泉州市2010-2012年猪繁殖与呼吸综合征的病原学调查

黄长春 福建省泉州市动物疫病预防控制中心362000

泉州市2010-2012年猪繁殖与呼吸综合征的病原学调查

黄长春 福建省泉州市动物疫病预防控制中心362000

为初步了解该病在泉州市的流行情况，以科学有效地防控猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），采用荧光定量RT-PCR方法对2010-2012年来自泉州市各县（市、区）养殖场（户）的212份临床疑似病例样品和441份健康生猪拭子进行PRRSV病原学检测，结果显示54份疑似病例样品为阳性，阳性率为25.47%；49份拭子样品阳性，阳性率为11.11%。将PRRSV阳性病料（拭子）进行CSFV、PCV-2、PRV检测，仅有38份样品表现为PRRSV单独感染，其他均有一种或多种其他病毒感染，占样品检测数的36.89%，混合感染的占样品检测数的63.11%。通过调查表明，PRRS感染在泉州市猪群中还普遍存在和流行，并有从单一感染向混合感染扩大的趋势。

猪繁殖与呼吸综合征RT-PCR病原学调查

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起猪繁殖障碍和呼吸道疾病的急性、高度传染的病毒性传染病[1]。国际动物卫生组织（OIE）将该病列为B类传染病，我国也将其列为二类传染病。高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株（HP-PRRSV）引起的一种急性、高死亡率猪传染病，我国将其列为一类传染病[2]。

我国自1996年报道存在该病以来[3]，全国几乎每个省（市、自治区）都报道过，给养猪业带来了巨大损失。福建自1997年报道以来，呈现蔓延及扩大趋势[4-6]。为了解PRRS在泉州市的流行情况，2010-2012年，通过现场采样和养殖场（户）送样方式，采集临床有繁殖障碍、呼吸道疾病及外观健康无症状猪群的组织（拭子）样品653份，应用RT-PCR方法进行猪繁殖与呼吸综合征病毒检测。

1 材料与方法

1.1 样品采集采集泉州市部分临床具有繁殖障碍或者呼吸道疾病症状的肺、扁桃体、淋巴结、脾等有明显病变部位与健康部位交界的组织以及鼻腔拭子、口腔拭子等，置于-20℃保存备用。另采集外观健康正常无临床症状的猪只样品（鼻腔拭子、口腔拭子、精液或粪便拭子等），置于-20℃保存备用。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂总RNA极速抽提试剂盒由上海飞捷生物技术有限公司生产，试剂盒包括：RA2裂解液、洗液、洗脱液、内套管和外套管。

病毒核酸提取试剂盒由台湾旭基科技股份有限公司生产，试剂盒包括：VB裂解液、AB浓缩液、W1缓冲液、洗液、RNase-free water、内套管和外套管。

猪蓝耳病病毒荧光RT-PCR检测试剂盒、猪瘟病毒荧光RT-PCR检测试剂盒、猪圆环病毒Ⅱ型荧光PCR检测试剂盒、伪狂犬病病毒荧光PCR检测试剂盒均由北京生科尚仪科技有限公司生产，试剂盒包括：RT-PCR反应液、RT-PCR酶、Taq酶、阳性对照、阴性对照。

1.2.2 主要仪器Tissuelyser II组织匀浆机（德国QIAGEN）；IEC-3593离心机（美国国际设备公司）；Class Typa II生物安全柜（美国labconco公司）；Fresco 17高速冷冻离心机（德国Thermo公司）；StepOne荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；eppendorf可调单道、多道移液枪（德国）。

1.3 方法与步骤

1.3.1 待检样品处理

1.3.1.1 组织样品取待检组织样品（病变与健康部位交界处）2.0 g放入1.5 mL eppendorf管中，加入PBS 1.0 mL，置于组织匀浆机20次/s匀浆2 min，10 000 r/min离心3 min，取上清液备用。

1.3.1.2 精液冻融2次或者超声波裂解，以10 000 r/min离心10 min，取上清液备用。

1.3.1.3 拭子等直接10 000 r/min离心1 min，取上清液备用。

1.3.2 样品RNA提取（1）将RT-PCR检测试剂盒的阴性对照、阳性对照和处理好的样品中吸取100 μL上清液放入1.5 mL eppendorf管中，加入RA2液500 μL，充分颠倒混匀5～10次，静置1 min。（2）将样本裂解物全部吸入或倒入内套管（已插在外套管中），离心1 min。（3）取出内套管，吸去外套管中液体后放回内套管，加入500 μL洗液，离心1 min。（4）重复步骤3再洗1次。（5）取出内套管，吸去外套管中液体后放回内套管，不加洗液，离心1 min。（6）将内套管移入新的1.5 mL eppendorf管，在膜中央加入洗脱液25～50 μL。（7）室温静置1 min后，离心1 min，获得总RNA。

1.3.3 样品DNA提取按照检测试剂使用说明书提取。

1.3.4 PCR扩增以RNA核酸为例，DNA核酸扩增根据检测试剂使用说明进行操作。

1.3.4.1 扩增试剂准备按每15 μL RT-PCR反应液加入0.25 μL Taq酶的量配制计算好各试剂的使用量，加入到1.5 mL eppendorf管中，充分混匀，2 000 r/min离心10 s，向每个PCR管中各分装15 μL。

1.3.4.2 加样（样本处理）在各设定的PCR管中分别加入上述制备的RNA溶液10 μL，盖紧管盖，离心至管内无气泡，然后将PCR管牌号放入荧光定量RT-PCR检测仪内，按表1条件设置后运行。

1.4 结果判断试验成立条件：阴性对照的Ct值赢等于none；阳性对照的Ct值应小于等于28.0。Ct值为none的样本为阴性；Ct值小于等于30.0的样本为阳性。Ct值大于30.0的样本建议重做，重做结果Ct值为none为阴性，否则为阳性。对于某些为呈现S型曲线，但本底较高的样本，应为阴性。

表1 循环条件

2 结果

2.1 部分病料（阳性样品）荧光定量RT-PCR扩增曲线结果见图1-图2。

图1 病料（阳性样品）RT-PCR扩增曲线a

图2 病料（阳性样品）RT-PCR扩增曲线b

2.2 临床上存在繁殖障碍或者呼吸道疾病症状样品检测结果从表2可看出，对临床具有繁殖障碍或呼吸道症状72个养殖场（户）212份样品进行PRRSV病原检测，结果养殖场（户）和阳性数分别为23个和54份，阳性率分别31.94%和25.47%。

表2 临床有繁殖障碍或者呼吸道疾病症状样品检测结果

2.3 外观健康猪只样品检测结果从表3可看出，采集的86个养殖场（户）441份样品进行PPRSV病原检测，有12个养殖场（户）49份样品阳性，阳性率为13.95%和11.11%。

表3 外观健康猪只样品检测结果

从表4可看出，对35个养殖场（户）103份检测PRRSV阳性样品再进行CSFV、PCV-2和PRV病原检测，单一感染PRRSV的养殖场（户）个数和样品阳性数分别为10个和38份，阳性率为28.57%和36.89%；混合感染的养殖场（户）数和样品阳性数分别为25个和65份，阳性率为71.43%和63.11%。

从表5可看出，2010-2012年间，采集的158个养殖场（户）653份样品应用RT-PCR检测PRRSV病原，阳性数为35个和103份，阳性率为22.15%和15.77%。

3 分析与讨论

表4 PRRS与猪瘟、圆环病毒2型、伪狂犬病混合感染情况

表5 样品检测汇总表

1）对临床存在繁殖障碍或者呼吸道症状的72个养殖场（户）212份病料样品进行实时荧光定量RT-PCR检测，结果有23个养殖场（户）54份PRRSV阳性，猪场和病料样品阳性率分别31.94%和25.47%。进一步证实了PRRSV在泉州地区还普遍存在和流行，应引起各个养殖场（户）的重视。

2）对外观无表现繁殖障碍或呼吸道疾病的健康猪只进行拭子采样，采集86户441分样品，结果显示有12个养殖场（户）49份样品PRRSV阳性，场（户）数和样品数阳性率分别为13.95%和11.11%，表明该地区存在PRRSV感染的可能性，应该引起养殖场（户）的高度重视。

3）对PRRSV阳性病料再进行猪瘟、圆环病毒2型和伪狂犬病病毒检测，结果显示PRRSV单一感染的仅10个养殖场（户）38份样品，就分别占总数的28.57%和36.89%，而以上三种混合感染的阳性猪场和阳性病料样品分别占71.43%和63.11%，表明疫病有从单一型往混合型蔓延的趋势，这与杨先进、孟祥珍等的研究基本一致[7-8]，建议在进行防治PRRS时，要统筹兼顾做好其他疫病的防控工作。

参考文献：

[1]蔡宝祥.家畜传染病学[M].4版.北京:中国农业出版社, 2001:211-213.

[2]中华人民共和国农业部.中华人民共和国农业部公告第1125号[EB].2008.

[3]郭宝清,陈章水,刘文兴,等.从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV病毒的研究[J].中国畜禽传染病,1996(2):1-5.

[4]关育芳,金颜辉,柳琳,等.福建省猪繁殖与呼吸综合征血清学调查[J].福建畜牧兽医,1997(6):4.

[5]杨小燕,李晓华,沈绍新,等.猪繁殖与呼吸综合征血清学调查[J].中国兽医杂志,2001,37(4):17-18.

[6]庄向生,车勇良,陈少莺,等.RT-PCR技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒[J].福建农业学报,2007,22(1):135-138.

[7]杨先进.长江中下游地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查及其在规模猪场的防控[D].南京农业大学,2008.

[8]孟祥珍.潍坊地区猪"高热病"流行病学调查和防控[D].山东农业大学,2009.

The epidemiological investigation of porcine reproductive and respiratory syndrome in Quanzhou city

Huang Changchun
(Quanzhou Animal Disease Prevention and Control Center,Fujian 362000)

To get an understanding of the current status of PRRS in Quanzhou and provide scientific basis for effectively controlling PRRS,the study employs RT-PCR to carry a test for PRRSV pathogen on 212 samples of clinically suspected cases of PRRS disease and 441 healthy pig swabs,which have been collected from farms of Luojiang district,Quangang district,Quanzhou Taishang districts and other 6 districts in Quanzhou from 2010-2012.The result shows that the positive rate among 212 samples of clinically suspected cases of PRRS disease is 25.47%,and 49 swab samples are positive,with positive rate of 11.11%.Tested on PRRSV positive disease materials(swabs)for CSFV,PCV-2,PRV,only 38 samples show PRRSV infection alone,others have more than one virus infection, accounting for 36.89%.The mixed infection rate reaches 63.11%.The reach shows that PRRS is prevalent in Quanzhou and has the tendency to develop from single infection to mixed infection.

Porcine reproductive and respiratory syndrome RT-PCR aetiological investigation

A

1003-4331（2015）06-0008-04