Kappa检验比较2种猪伪狂犬病gE抗体ELISA检测试剂盒

杨 涛 李谓娟

（1.厦门市动物疫病预防控制中心361009；2.厦门市同安区动物卫生监督所361100）

Kappa检验比较2种猪伪狂犬病gE抗体ELISA检测试剂盒

杨 涛1李谓娟2

（1.厦门市动物疫病预防控制中心361009；2.厦门市同安区动物卫生监督所361100）

采用2种猪伪狂犬病gE抗体ELISA检测试剂盒分别检测1 100份猪血清，应用Kappa检验比较试验数据的一致性。结果显示：2种猪伪狂犬病抗体检测试剂盒都具有很好的重复性，检测定性结果一致性强度为极好，Kappa值=0.929（95%置信区间：0.899～0.959），其符合率达98.2%，说明2种猪伪狂犬病抗体检测试剂盒都适用于PRV gE抗体检测。

猪伪狂犬病ELISA试剂盒Kappa检验

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的多种家畜和野生动物感染的一种急性传染病，也是严重危害规模养猪场的主要传染病之一。猪伪狂犬病是《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020）》中优先防治和重点防范的动物疫病，并纳入重点疫病净化考核内容。疫苗免疫是有效防治猪伪狂犬病的关键措施，目前，国内外普遍采用伪狂犬病病毒基因缺失疫苗对该病进行免疫预防，配套使用相应的抗体酶联免疫吸咐试验（ELISA）检测试剂盒对猪血清中PRV野毒抗体进行检测，从而能有效监测猪群中PRV野毒感染情况[1-2]，并据此确定下一步的PR控制和净化措施，因此，PR抗体检测的准确性显得尤为重要。PRV基因组为线性双链DNA，可编码70～100种蛋白质，糖蛋白有11种，即gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN，其中gE为病毒复制非必需的糖蛋白，与病毒在神经系统中的侵袭和扩散密切相关，是影响PRV生长的功能成分[3]，并作为标志基因用来区分疫苗免疫和野毒感染。目前市场上有不同厂家生产的PRV gE抗体检测试剂盒，本研究选取2种进口PRV gE抗体检测试剂盒，对相同的猪血清样品分别进行检测，比较2种试剂检测的一致性。

1 材料与方法

1.1 猪血清1 100份猪血清，采自5个规模猪场。

1.2 检测试剂猪伪狂犬病病毒gI（gE）抗体检测试剂盒，IDEXX生产，批号：CL456；猪伪狂犬病病毒gE抗体检测试剂盒，ID.vet生产，批号：716。

1.3 检测方法猪伪狂犬病病毒gI（gE）抗体检测试剂盒：猪血清用试剂盒自带稀释液稀释2倍后，平行加样各2孔(100 uL/孔)，反应同时设阳性和阴性对照各2孔。室温下孵育60 min，洗涤3次后，加酶标抗体100 uL，室温下孵育20 min后再洗涤，加底物液100 uL，室温避光显色15 min，加50 uL终止液终止反应，用酶标仪于650 nm波长测定OD值并计算S/N值（S/N＝样品OD值/阴性对照平均OD值），其中S/N≤0.6为阳性，＞0.7为阴性，0.6＜S/N≤0.7为可疑。

猪伪狂犬病病毒gE抗体检测试剂盒：每孔加入试剂盒自带稀释液20 uL后平行加样各2孔（50 uL/孔），同时加阳性和阴性对照各2孔，37℃孵育90 min，洗涤3次后，加酶标抗体100 uL，室温下孵育30 min后再洗涤，加底物液100 uL，室温避光显色15 min，加100 uL终止液终止反应，用酶标仪于450 nm波长测定OD值并计算S/N%值（S/N%＝样品OD值/阴性对照平均OD值*100），其中S/N%≤60%为阳性，＞70%为阴性，60%＜S/N≤70%为可疑。

如同份样品检测结果不一致，再进行1次检测，最终结果取2次相同的判定结果。

1.3 统计方法检测数据采用EXCEL处理，使用SPSS20.0做统计分析，对2种试剂盒检测的结果一致性应用Kappa检验(值)，检验水准为＝0.05。值≤0.40时，表明一致性较差；0.40＜值≤0.60时，表明中度一致；0.60＜值≤0.80时，表明有较高的一致性；值＞0.80，表明有极好的一致性[4]。符合率指2种试剂定性为相同结果样本数之和除以检测总数。

2 结果与分析

对2种试剂盒的可重复性进行评价。IDEXX猪伪狂犬病病毒gI（gE）抗体检测结果显示1 100份样品中有9份样品平行结果不一致，ID.vet gE抗体检测结果显示1 100份样品中有5份样品平行结果不一致。分析发现这14份样品的检测结果都是介于阳性和阴性之间，见表1。

表1 2种试剂检测结果的重复性

2种试剂盒联合检出928份阳性和149份阴性，符合率为98.2%。根据Kappa一致性检验，Kappa值为0.929（95%置信区间：0.899～0.959），表明2种试剂盒的一致性为极好，见表2。在2种试剂检测结果不相符的20份样品中，差异也主要集中在判定结果位于临界值附近的样品,其中IDEXX的S/N值在0.436～0.873，ID.vet的S/N%值在44.3%～89.5%（见表3）。

表2v2种试剂检测结果一致性分析

表3 20份不相符样品检测值比较

3 讨论

Kappa检验是用于检验分类变量资料一致性和重现性的统计指标，可以研究不同诊断方法结果间或不同观察者评定结果间的一致性，近年人们常用Kappa分析评价2种检测方法、2名检验人员或者2种设备检测结果的符合程度，以及用同一种方法进行多次测定的结果能否重现的问题。Kappa统计量通常是将观察的一致性与偶然一致性进行比较，取值范围介于-1和+1，如值＜0，表示由机遇所致一致率大于观察一致性，2次检查的结果很不一致，但在实际应用中无意义；值＝0，表示观察一致率完全由机遇所致，如值＞0，说明观察一致性大于因机遇所致一致的程度，Kappa值越大，表明2种结果可靠程度越高。除了Kappa检验外，国际上还可以依据美国临床实验室标准化协会（CLSI）EP12-A2文件对2种定性检测方法的一致性进行比较[5]，按照EP12-A2文件的公式，把检测结果定性为阴性和非阴性，计算出这2种试剂盒检测PRV gE抗体一致程度的95%可信区间为98.1%～99.4%。

本试验中发现2种试剂检测结果的差异主要集中在判定结果位于临界值附近的样本，而临界值浓度是ELISA定性试验唯一的决定水平。临界值浓度样本具有多次重复检测出现阴、阳性概率各占50%的特点，并且在临界值浓度范围95%区间的样本都不易得到稳定的检测结果[6]，而大大超过临界值水平的阴、阳性样本的结果却较为稳定。因此，如果样本浓度在临界值浓度附近，会出现相同试剂多次检测同一样本结果不一致的现象。

目前猪场普遍使用PRV gE基因缺失弱毒苗防控PR，PRV gE抗体试剂盒的应用为PR的控制和净化创造了有利条件，并已成为PR诊断和评价PR防治效果及疫病净化的有效手段。试验结果表明，2种试剂检测结果高度一致，均可应用于临床检测。

[1]邹敏,杨旭兵,郑辉,等.2012-2013年我国部分地区猪伪狂犬病流行病学调查[J].中国动物检疫,2015,32(4):1-5.

[2]占松鹤,刘华,周迎春,等.安徽省规模化种猪场猪伪狂犬病血清学调查[J].动物医学进展,2015,36(3):124-127.

[3]吕素芳,郭广君,魏凤,等.猪伪狂犬病病毒gE-/gI-/TK-多基因缺失活疫苗对猪的安全性与免疫效力研究[J].动物医学进展,2014,35(4):1-5.

[4]颜虹.医学统计学[M].北京:人民卫生出版社,2009:21.

[5]黄妩姣,黄宪章,庄俊华,等.CLSI EP12-A2文件在HBeAb定性检测性能评价中的应用[J].检验医学,2012,27 (11):900-903.

[6]杨有业,张秀明.临床检验方法学评价[M].北京:人民卫生出版社,2008:296-312.

Application of Kappa test for evaluation of PRV gE antibody ELISA kits

Yang Tao1Li Weijuan2
（1.Xiamen Center for Animal Disease Control and Prevention,361009; 2.Tongan Animal Health Inspection Institute,Xiamen 361100）

To compare the consistency between the results of two different PRV gE antibody ELISA kits by Kappa test.1 100 swine serum samples were tested by the PRV gE antibody ELISA kits produced by two different firms.The results showed that the two kits both had good repeatability,and the consistency rate was 98.2%.The Kappa value was 0.929(95%CI∶0.899,0.959).two kits are both applicable to detect PRV gE antibody.

pseudorabies ELISA kit Kappa test

A

1003-4331（2015）06-0011-03

厦门市科技计划项目（3502Z20154095）资助。

杨涛(1971-)，女，硕士，副研究员，主要从事动物疫病监测与兽医流行病学研究。