鸡传染性法氏囊病的实验室诊断

梁晓君 福建省南靖县畜牧技术服务站363600

鸡传染性法氏囊病的实验室诊断

梁晓君 福建省南靖县畜牧技术服务站363600

采集病死鸡法氏囊经处理后绒毛尿囊膜途径接种5枚SPF鸡胚，接种胚均于接种后48～96 h死亡，死亡胚病变特征为体表和皮下出血，胚水肿，肾脏出血，肝脏有坏死灶，心肌苍白。琼扩试验结果显示法氏囊样品孔、绒毛尿囊膜样品孔与标准血清孔间均可出现明显的沉淀线，说明样品中含有传染性法氏囊病病毒。根据实验室检查情况，诊断为鸡传染性法氏囊病。

鸡传染性法氏囊病实验室诊断

鸡传染性法氏囊病，是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的急性、高度接触性传染病。其发病率较高，且病程较短。各品种鸡均能感染，雏鸡被感染后，会导致其出现免疫抑制现象，并可能使多种疫苗免疫失败或诱发疫病的产生，给养殖户（业）造成的危害和经济损失较为严重。

2013年5月18日，南靖县山城镇某养鸡户所养的3 700多羽土鸡发生疫病，发病日龄为40日龄，主要症状是患鸡排白色水样稀粪，且肛门周围有粪便污染，羽毛蓬乱，发病率100%，病死率41%。病初户主用头孢氨苄、庆大霉素、灭毒清等药物对患鸡进行治疗，但效果甚微，于5月20日上午送南靖县动物疫控中心化验室检验，根据临床诊断、病理变化观察及实验室检验结果，确诊为鸡传染性法氏囊病。

1 材料与方法

1.1 试验材料鸡传染性法氏囊病病毒标准抗原和标准阳性血清、10日龄SPF鸡胚；主要试剂包括琼脂、氯化钠、蒸馏水、磷酸缓冲液盐水、青霉素、链霉素等；试验器材包括培养皿、打孔器、移液器等。

1.2 临床诊断对送检的5羽病死鸡逐一进行剖检，观察其病理变化。

1.3 病料采集与处理采集具有典型病变的法氏囊，用加有抗生素（1 000 IU/mL青霉素和1 000 μg/ mL链霉素）的PBS制备成20%匀浆液，3 000×g离心10 min，收集上清液，置4℃作用1～4 h，于-20℃保存备用。

鸡胚接种：取处理好的病料0.2 mL，通过绒毛尿囊膜途径接种到5枚10日龄SPF鸡胚中。具体方法为：取10日龄SPF鸡胚，选择一处血管比较少的部位，在卵壳上锯1个小三角，然后用碘酊和酒精进行消毒，接着在气室的中央钻一小孔，轻轻挑开壳膜，在刺破的地方滴加生理盐水，将橡皮乳头放在气室的中间吸气，使气室内产生负压，此时绒毛尿囊膜会下陷，从而形成人工气室，紧接着接种样品于绒毛尿囊膜上，并用盖玻片盖于卵窗上，最后用石蜡将其密封。鸡胚接种完后，需横放于保温箱中，且严禁翻动，并使卵窗方位保持向上。接下来，每天用照蛋器检卵1次，若24 h内死亡，则将其废弃。废弃的鸡胚收取后，需放置在4℃冰箱内，然后在无菌条件下打开鸡胚气室，将尿囊液和绒毛尿囊膜收取，接着放入无菌的青霉素瓶内，置于-20℃冰箱等待进一步鉴定，同时观察鸡胚的病变情况。

1.4 病毒鉴定采用琼脂扩散试验（AGP）进行IBDV抗原鉴定。

1.4.1 抗原制备取具有典型病变的法氏囊组织或收获的鸡胚绒毛尿囊膜，剪碎、研磨，以PBS液稀释成1∶5的乳剂，-20℃反复冻融3次，经2 500 r/min离心沉淀后，取上清液，置低温冰箱中保存备用。

1.4.2 琼脂板的制备在正式试验24 h前制备琼脂板，将琼脂1 g、氯化钠8 g加入到100 mL蒸馏水中，调pH至7.0～7.2后，水浴溶化。然后将充分溶化的琼脂倒入平皿中，琼脂板厚度约3 mm，冷却后放入冰箱中保存备用。

1.4.3 琼脂扩散试验用打孔器在琼脂板上打7个孔，其中中间1个孔，孔径为3 mm，外周6个孔，孔径均为3 mm，孔距3 mm，见图1。

图1 琼脂板示意图

首先，中央的7号孔用已知的标准阳性血清加满；其次，将标准抗原加入到1、4号孔内；接着在2、3号孔内加入处理好的病死鸡法氏囊组织样品；最后在5、6号孔内加入精处理的接种病料样品后死亡鸡胚的绒毛尿囊膜样品，每孔加满为止，放置湿盒内，于37℃反应24 h后观察，并记录结果。

2 结果

2.1 临床诊断结果经剖检，送检的5羽病死鸡呈现典型的鸡传染性法氏囊病的病变特征。病死鸡表现出腺胃和肌胃的交界处有条状出血症状，肌肉脱水，胸部、腿部的肌肉有出血状，同时黏膜皱褶上也有出血点（斑），法氏囊水肿，肾脏肿大明显且有尿酸盐沉积。见图1（a、b、c）。

2.2 鸡胚接种结果5枚接种鸡胚均于接种后48～96 h死亡，死亡胚病变特征为体表和皮下出血，胚水肿，肾脏出血，肝脏有坏死灶，心肌苍白。

图2 送检病死鸡的剖检病变

2.3 琼脂扩散试验结果标准抗原孔与标准血清孔之间形成1条明显的、致密的白色沉淀线，法氏囊样品孔、绒毛尿囊膜样品孔及标准血清孔间均出现明显的沉淀线，根据以上试验，结果判定为阳性。

3 讨论

1）在问诊中了解到，该养鸡户为图省事一直对雏鸡采用饮水免疫的方法进行鸡传染性法氏囊病免疫，因为受到母源抗体的影响，使受免疫的鸡群产生的抗体水平不高甚至较低，且不均匀，造成鸡群发病。同时还了解到该养殖户饲养管理粗放，育雏温度低，饲养密度大，鸡舍潮湿，通风不良，卫生条件差，饲料中蛋白质水平过低，微量元素和维生素缺乏等，这些都可能是诱发病变的原因。所以，养鸡户应全面实行科学的饲养管理。经常清除粪便，勤换垫料，搞好鸡舍的环境卫生并定期进行消毒，保证鸡群健康生长和具有良好的抗病能力。

2）免疫接种对鸡传染性法氏囊病的防治有显著效果，然而在选择疫苗时必须根据当地的IBD疫情选择疫苗。该养殖户因盲目跟从其他地方对疫苗的选择而没有考虑到当地实际的疫情，导致免疫失败。所以，在实际生产中必须根据自身的情况制定一套免疫程序。一般情况如下：对14～16日龄雏鸡可用中等毒力弱毒疫苗（如CH80）进行免疫，1次即可；对受IBDV污染较严重的鸡场或母源抗体不均匀的鸡场，可用活苗分2次进行免疫，首次免疫为10～12日龄，第2次免为16～18日龄，接种疫苗可以选择中强毒苗（如法贝灵）；对受IBDV污染尤其严重的鸡场可使用组织灭活苗进行免疫，免疫可选择在7～10日龄进行，这样鸡群就能产生抗体，得到较好的保护。其次种鸡还应选择在以下2个时间段进行灭活苗注射，分别是18～20周龄和40～42周龄，以便更好地提高雏鸡的母源抗体水平。

Laboratory diagnosis to a case of infectious bursal disease

Liang Xiaojun
(Fujian Nanjing County Livestock Technology Service Station,363600)

Suspensions of tissues(20%w/v)were prepared in sterile phosphate buffered saline(PBS)added with sutiable antibiotics. The suspensions were clarified by low-speed centrifugation and 0.2 mL samples were inoculated into the chorioallantoic membrane of 10-day-old embryos.Eggs were candled daily for 5 days with mortality within the first 24 hours being considered nonspecific.Death of embryos occurred between 48～96 h post inoculation and showed specific features of IBDV infection.The samples of bursa collected from dead chicks and chorioallantoic membrane harvested from dead embryos were prepared for Agar gel immunodiffusion test.The results showed that there were clear white sediment lines between samples and standard antisera.According to the above results,the case could be determined as Infectious bursal disease.

Chick Infectious bursal disease Laboratory diagnosis

A

1003-4331（2015）06-0016-02