衍生化GC／MS同时测定樟芝菌粉中19种脂肪酸的含量

张奉苏，陈 菲，杨念云，刘训红，侯 娅，马 阳，陆娟娟

（南京中医药大学药学院，江苏南京 210023）

衍生化GC／MS同时测定樟芝菌粉中19种脂肪酸的含量

张奉苏，陈 菲，杨念云，刘训红，侯 娅，马 阳，陆娟娟

（南京中医药大学药学院，江苏南京 210023）

建立了衍生化气相色谱－质谱联用（GC／MS）同时测定不同批次、不同培植方式樟芝中19种脂肪酸含量的方法。采用HP－VOC毛细管色谱柱（60m×320μm×1．8μm），选择离子扫描方式（SIM），对不同批次樟芝菌粉超临界CO2流体萃取物的甲酯化样品进行分析。19种脂肪酸的响应峰面积与其相应浓度的线性关系良好（r＞0．995 6），加样回收率为93．47％～104．89％。该方法准确、专属、重复性好，能有效测定樟芝菌粉中脂肪酸的含量，可为樟芝菌粉的质量评价奠定基础。

樟芝菌粉；脂肪酸；GC／MS；超临界CO2萃取

樟芝（Antrodia camphorata）又称牛樟菇、牛樟芝、樟内菇、红樟菇等，分布于台湾山区海拔450～2 000m之间的牛樟树（Cinnamomum kanehirai Hay）腐朽的心材内壁，具有黄樟香气味，是上等的食药两用真菌［1］。现代研究表明［2］，樟芝含有多糖、三萜、腺苷、脂肪酸等成分，具有抗氧化、抗炎、强化免疫、扩张血管等药理作用。樟芝作为一种极具开发潜力和应用前景的保健、药用菌，近年来逐渐成为国内外研究和开发的热点［3－4］。目前，保健食品发展方向是向功能因子明确的第3代产品转移，保健功能因子的研究已引起国内外高度重视［5］。

脂肪酸在生命过程中具有非常重要的作用，它不仅是肌体最重要的能量来源，还参与多种生理活动［6－9］。樟芝中脂肪酸是其药效成分及保健功能因子之一，可作为质量评价的一项重要指标。目前有关樟芝菌粉的研究多集中于多糖、三萜及核苷类成分［10－12］，迄今国内外尚未见樟芝菌粉脂肪酸含量分析的相关报道。超临界CO2流体萃取法因具有操作方便、能耗低、无污染、纯度高、无溶剂残留等特点，已广泛应用于植物油脂研究［13－15］。本实验在前期研究的基础上［16－20］，采用超临界CO2流体萃取法对不同批次、不同培植方法樟芝中的脂肪酸进行衍生化GC／MS分析，并同时测定其中19种脂肪酸的含量，旨为樟芝菌粉内在质量的综合评价和全面控制提供可靠的检测方法。

1 实验部分

1．1 仪器与材料

Agilent 7890A／5975C型气相色谱－质谱联用仪：美国Agilent公司产品；HA220－40－11超临界萃取装置：江苏省南通华安超临界萃取有限公司产品；RE－52A型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂产品；HH－S型水浴锅：巩义市英峪予华仪器厂产品；Anke TGL－16B离心机：上海安亭科学仪器厂产品；BT125D十万分之一电子天平：德国Sartorius公司产品。

樟芝样品C1～C10普通发酵菌粉（批号分别为02L07，02L11，02L14，02L18，02L21，02L25，02L28，03L04，03L07，03L11）、三萜含量较高的发酵菌粉ST（批号为0J10D17）、樟芝胶囊T6（批号为0J02L07）、椴木栽培樟芝子实体D：由台湾长庚生物科技股份有限公司提供；灵芝CZ（赤芝）：收集于安徽亳州药材市场。以上各样品均经品种鉴定，留样凭证存放于南京中医药大学中药鉴定实验室。

辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、（Z）－十六烯酸、十七酸、硬脂酸、反油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸、山嵛酸、芥酸、二十三烷酸、木蜡酸、顺－15－二十四酸对照品（纯度大于99％）：美国Sigma－Aldrich公司产品；甲醇、正己烷均为色谱纯；水为重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

1．2 实验条件

1．2．1 色谱条件 HP－VOC弹性石英毛细管柱（60m×320μm×1．8μm）；程序升温：初温80℃，以10℃／min升至150℃，保持5min，以3℃／min升至195℃，保持5min，以2℃／min升至230℃，保持10min；进样口温度250℃；分流比10∶1；进样量0．6μL；载气（氮气）流速10mL／min。

1．2．2 质谱条件 EI离子源，离子源温度230℃，电子能量70eV，四极杆温度150℃，溶剂延迟时间3min，扫描范围m／z 40～350，选择离子扫描方式（SIM），电子倍增器电压700V。

1．2．3 供试品制备 采用超临界CO2萃取技术，萃取釜压力20MPa，萃取温度48℃；分离釜Ⅰ压力7MPa，温度40℃；分离釜Ⅱ压力5MPa，温度35℃；萃取时间90min；CO2流速30L／h。称取100g各样品发酵菌粉（过40目筛），分别置于萃取釜中萃取，从分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ中收集样油。

称取200μL样油，置于10mL具塞试管中，加入2mL 0．4mol／L氢氧化钾的甲醇溶液，摇匀，60℃水浴中放置20min；待油滴溶解冷却至室温，加3mL BF3－CH3OH溶液，摇匀，60℃水浴中放置6min；加3mL正己烷，保持微沸3min，取出冷却至室温，振摇；加2mL饱和氯化钠溶液，静置，吸取上清液，加无水Na2SO4干燥后，过0．22μm滤膜，待分析。

1．2．4 对照品制备 精密称取各对照品适量，置于50mL锥形瓶中，按1．2．3节进行甲酯化，即得含19种脂肪酸甲酯的对照品储备溶液。

1．2．5 分析方法 用HP－VOC色谱柱对色谱分离条件进行优化，确定最佳分离条件。通过对

萃取压力、温度和时间进行考察，确定样品的超临界CO2流体萃取的最佳条件。样品按选定的萃取条件及分析条件进行衍生化GC／MS分析，利用外标法计算各样品中19种脂肪酸的含量。

2 结果与讨论

2．1 超临界CO2流体萃取条件的优化

本实验考察了不同萃取压力、温度和时间条件对樟芝菌粉脂肪油萃取得率的影响。最终确定最佳萃取条件为：萃取压力20MPa，萃取温度48℃，萃取时间90min；分离釜Ⅰ压力7MPa，温度40℃；分离釜Ⅱ压力5MPa，温度35℃。

2．2 系统适用性实验

混合对照品溶液与樟芝菌粉中脂肪油的成分总离子流图示于图1。由图1可见，19种脂肪酸类成分可完全分离，且分离度均大于1．5。

由于采用了特征离子扫描，消除了样品基质的干扰，因此能够进行比较准确的定性和定量分析。选择质量数较大、相对丰度较大的碎片离子作为定量离子，依此原则再选择2～3个碎片离子作为定性离子，以定量离子和定性离子共流出与否以及丰度比来判断样品是否含有目标化合物，由定量离子积分来定量，得到肉豆蔻酸的质谱图示于图2。

2．3 线性关系考察

用正己烷稀释对照品储备溶液至不同浓度，分别取0．6μL相当于储备液浓度1／4、1／8、1／16、1／32、1／64、1／128的对照品溶液，按上述条件进样分析。以各对照品峰面积积分值y对进样浓度x做线性回归计算，结果列于表1。

2．4 方法学相关考察

取同一对照品溶液及相应的供试品（C1、D、C2），按上述分析条件对精密度、稳定性、重复性及加样回收率进行考察，测得19种脂肪的各项相对标准偏差（RSD），结果列于表2。

2．5 样品测定

精密称取各樟芝菌粉药材样品（C1～C10、ST、T6、D、CZ），按照1．2．3方法制备供试品溶液，在1．2．1和1．2．2条件下分别测定各脂肪酸成分的含量，结果列于表3。

图1 混合对照品（a）及樟芝菌粉样品C8（b）的脂肪酸成分总离子流色谱图Fig．1 Total ion current chromatogram（TIC）of nineteen fatty acids in reference substances（a）and Antrodia camphorata powder（b）

图2 肉豆蔻酸的EI－MS／MS质谱图Fig．2 EI－MS／MS spectra of myristic acid

表1 19种脂肪酸的回归方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限Table 1 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges，LOD and LOQ of nineteen fatty acid

表2 19种脂肪酸的方法学考察结果Table 2 Methodological study results of nineteen fatty acid

表3 樟芝菌粉中19种脂肪酸含量的测定结果（n=3）Table3 Contents of 19 fatty acids in Antrodia camphorata powder

2．6 结果分析

测定结果表明，不同批次樟芝发酵菌粉（C1～C10）中，19种脂肪酸的总含量范围为9．26～18．74mg／g，平均值为11．97mg／g。其中，亚油酸的含量最高，其次为油酸、反油酸和棕榈酸。三萜含量较高的樟芝发酵菌粉（ST）、樟芝胶囊（T6）的脂肪酸总含量分别为12．01mg／g、9．73mg／g，均在上述范围之内，且脂肪酸种类的差异不大，由此可见，这两种樟芝商品与不同批次普通樟芝菌粉的脂肪酸成分差异不大。椴木栽培的樟芝子实体（D）及灵芝样品（CZ）中的脂肪酸总含量均远低于发酵菌粉的平均含量。

此外，椴木栽培的樟芝子实体含有菌粉中不存在的硬脂酸，但却不含亚麻酸和花生酸。

3 结论

三萜含量较高的樟芝菌粉（ST）、樟芝胶囊（T6）与不同批次樟芝菌粉（C1～C10）的脂肪酸在组成和含量上几乎无差异。椴木栽培的樟芝子实体（D）及灵芝样品（CZ）的脂肪酸组成和含量与不同批次樟芝菌粉间存在较大差异。樟芝菌粉中，含有较高的亚油酸、油酸、反油酸和棕榈酸。亚油酸是人体必需的脂肪酸，与脂类和胆固醇代谢密切相关，同时具有降低血脂和胆固醇、减少动脉粥样硬化、抑制癌细胞生长和促进大脑发育等作用［21］。油酸作为单不饱和脂肪酸，能提高机体的抗氧化能力，保护心血管系统［22］。棕榈酸能引起成骨肉瘤细胞（MG63细胞）的凋亡，具有一定的抗癌功效［23］。上述脂肪酸所表现出的生理功能与樟芝具有抗肿瘤和抗氧化作用一致，因此可认为樟芝菌粉所含有的这些脂肪酸为其功效物质基础之一。另外，亚油酸和亚麻酸为必需脂肪酸，是机体生命活动必不可少的物质，但却不能合成。实验结果表明，樟芝菌粉的不饱和脂肪酸含量高于灵芝，樟芝菌粉作为医药、保健市场的新兴产品，含有丰富的不饱和脂肪酸及人体必需脂肪酸，具有一定的药用、营养保健价值。

本实验建立了超临界CO2流体萃取、衍生化GC／MS同时测定樟芝菌粉中19种脂肪酸含量的方法，对不同批次、不同培植方法的樟芝菌粉进行比较分析，可以为樟芝菌粉内在质量的综合评价和全面控制提供可靠的检测方法。

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Simultaneous Determination of Nineteen Fatty Acids in Antrodia camphorata Powder by Derivatized GC／MS

ZHANG Feng－su，CHEN Fei，YANG Nian－yun，LIU Xun－hong，HOU Ya，MA Yang，LU Juan－juan
（Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing210023，China）

A method of derivatized gas chromatography－mass spectrometry（GC／MS）was developed for the simultaneous determinations of nineteen fatty acids in Antrodia camphorata of different batches and different cultivation．The analysis was carried on a HP－VOC capillary column（60m×320μm×1．8μm）with single ion monitoring（SIM）mode．Nineteen fatty acids show good linearity over the tested ranges（r＞0．995 6），and the recovery ranges from 93．47％to 104．89％．This method with good repeatability is found to be selective，accurate and suitable for the determination of fatty acids in Antrodia camphorata powder，which can provide the valuable materials for quality assessment of Antrodia camphorata powder．

Antrodia camphorata powder；fatty acids；gas chromatography－mass spectrometry（GC／MS）；supercritical CO2extraction method

O 657．63

A

1004－2997（2015）01－0078－07

10．7538／zpxb．youxian．2014．0021

2013－12－15；

2014－03－12

江苏省“药用生物资源研究与利用”优秀科技创新团队支持计划（2011）；江苏高校优势学科建设工程项目（ysxk－2010）资助

张奉苏（1988—），女，辽宁人，硕士研究生，生药学专业。E－mail：zfs＿sy＠163．com

刘训红（1959—），男，江苏人，教授，从事中药资源化学与品质评价研究。E－mail：liuxunh1959＠sohu．com

时间：2014－06－23；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0021．html