多壁碳纳米管净化－超高效液相色谱－串联质谱技术同时测定牛奶中青霉素类药物残留

曹 慧，陈小珍，朱 岩，李祖光，祝 颖，郑军科

（1．浙江省质量检测科学研究院，浙江杭州 310030；2．浙江大学化学系，浙江杭州 310028；3．浙江工业大学化学工程与材料学院，浙江杭州 310014）

多壁碳纳米管净化－超高效液相色谱－串联质谱技术同时测定牛奶中青霉素类药物残留

曹 慧1，2，陈小珍1，朱 岩2，李祖光3，祝 颖1，郑军科1

（1．浙江省质量检测科学研究院，浙江杭州 310030；2．浙江大学化学系，浙江杭州 310028；3．浙江工业大学化学工程与材料学院，浙江杭州 310014）

研究了多壁碳纳米管净化－超高效液相色谱－串联质谱技术同时测定牛奶中的羟氨苄青霉素、青霉素V、氨苄青霉素、苯咪青霉素、甲氧苯青霉素、青霉素G、苯咪青霉素、邻氯青霉素、乙氧萘青霉素和双氯青霉素药物残留。样品用乙腈沉淀蛋白，提取液用磷酸缓冲液稀释后，经改性的多壁碳纳米管材料净化，通过Waters C18色谱柱分离，以乙腈和10mmol／L乙酸铵（pH 4．5）溶液为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾－正离子多反应监测模式检测，内标法定量。10种青霉素药物在相应浓度范围内的线性相关系数均大于0．99，方法的定量限在0．1～10．0μg／kg之间。在低、中、高3个浓度添加水平下，10种青霉素药物的平均回收率为72．0％～110％，相对标准偏差在1．83％～9．33％之间。多壁碳纳米管材料具有较好的净化效果，该方法可以快速、准确地测定牛奶中的青霉素类药物残留。

多壁碳纳米管；固相萃取；超高效液相色谱－串联质谱（UPLC－MS／MS）；牛奶；青霉素

青霉素是一类广谱抗生素，具有消炎抗感染等作用，被广泛应用于畜牧养殖业［1］。由于不合理使用、不遵守休药期等原因，其残留问题逐渐成为人们关注的社会焦点，并成为引起畜禽产品消费安全和食品贸易争端的主要原因之一。

青霉素类药物残留的分析方法有微生物法、高效液相色谱法和液相色谱－串联质谱法。微生物法和高效液相色谱法的基质干扰严重，容易产生假阳性。超高效液相色谱－串联质谱（UPLC－MS／MS）技术是利用液相色谱的高分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度及丰富的结构信息相结合的强有力的分析工具，以其操作简便、准确度和灵敏度高、选择性强等优点成为药物残留检测的有效手段，是目前常用的检测方法［2－5］。国家标准GB／T 21315—2007中关于青霉素的检测不仅前处理复杂，且需要以固相萃取小柱净化来消除杂质干扰，由于商品化的固相萃取小柱价格昂贵，导致检测成本较高，而且长时间的前处理操作致使部分稳定性差的青霉素药物回收率不理想。

多壁碳纳米管（MWCNTs）是一种具有较强吸附性能的纳米材料，一般由2～50层石墨片组成，直径在几到几十纳米之间，长度可达几十甚至上百微米。由于其比表面积大，吸附能力强，对有机化合物、金属离子和有机金属化合物等具有较高的富集能力，可用作固相萃取吸附剂［6］。近年来，MWCNTs及其改性材料开始应用于挥发性物质［7］、农药［8－9］、兽药［10－13］的吸附研究，并作为新型材料应用于不同基质的净化［14－15］。

本工作利用改性后的MWCNTs固相萃取小柱净化牛奶基质，建立超高效液相色谱－串联质谱同时测定牛奶中青霉素类药物残留的方法，采用内标法定量，旨在为日常牛奶的检测提供方法参考和技术支持。

1 实验部分

1．1 主要仪器与装置

超高效液相色谱－质谱联用仪为XevoTMTQ－MS质谱仪，配备AcquityTM超高效液相色谱：美国Waters公司产品，配有电喷雾电离接口（ESI）及Masslynx数据处理系统；Milli－Q超纯水器：美国Millipore公司产品；高速离心机：美国Thermo公司产品；氮气吹干仪：天津市恒奥科技有限公司产品；涡旋混合器：太仓市华利达实验设备有限公司产品；固相萃取装置：美国Waters公司产品。

1．2 主要材料与试剂

乙腈（色谱纯）：德国Merck公司产品；甲酸（色谱纯）：美国Tedia公司产品；磷酸氢二钾（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司产品；水为Milli－Q系统纯化水；MWCNTs（纯度大于97％，直径40～60nm，长度5～15μm）：深圳市纳米港有限公司产品。

羟氨苄青霉素（纯度≥98．0％），青霉素V（纯度≥98．8％），氨苄青霉素（纯度≥99．0％），苯咪青霉素（纯度≥99．8％），甲氧苯青霉素（纯

度≥85．0％），青霉素G（纯度≥99．6％），苯唑青霉素（纯度≥92．0％），邻氯青霉素（纯度≥99．5％），乙氧萘青霉素（纯度≥86．0％），双氯青霉素（纯度≥99．0％），青霉素G－D7（纯度≥99．7％）标准品：均为德国Dr．Ehrenstorfer GmbH公司产品。

标准溶液的配制：分别准确称取10mg上述标准品于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1g／L储备液，密封储存于－18℃冰箱中。分别吸取50μL 1g／L标准溶液于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成5mg／L混合标准溶液，用时稀释成一系列浓度的标准溶液，待测。

0．05mol／L磷酸缓冲溶液的配制：称取8．7g磷酸氢二钾，超纯水溶解，稀释至1 000mL，调节pH 8．5。

1．3 实验条件

1．3．1 色谱条件 色谱柱：Waters Acquity BEH C18柱（2．1mm×100mm×1．7μm）；柱温35℃；样品温度25℃；进样体积5μL；流速0．2mL／min；流动相：pH 4．5的10mmol／L乙酸铵溶液（A），乙腈（B）；梯度洗脱程序：0～1．5min、20％B，1．5～2min、20％～40％B，2～7．2min、40％B，7．2～7．6min、40％～95％B，7．6～9．5min、95％B，9．5～10min、95％～20％B。

1．3．2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，多反应监测（MRM）模式，毛细管电压2．50kV，离子源温度150℃，脱溶剂气温度500℃，脱溶剂气流量1 000L／h。青霉素类药物的质谱参数列于表1。

表1 青霉素类药物的质谱参数Table 1 The mass spectrometry conditions of penicillins

1．4 多壁碳纳米管材料的处理

称取2g多壁碳纳米管粉末于250mL单口烧瓶中，分别加入50mL浓硫酸和100mL浓硝酸，超声振荡1h，静置后除去上层酸液，反复水洗至中性，烘箱烘干后研磨成细粉末。称取150mg多壁碳纳米管细粉末于6mL固相萃取空管中，垫上柱筛板压实，使用前用5mL甲醇、5mL水和5mL磷酸缓冲液活化。

1．5 前处理方法

称取5g牛奶于50mL离心管中，加入5mL乙腈，涡旋2min，混匀，离心后将上清液转移至100mL容量瓶中，用0．05mol／L磷酸缓冲液定容，混匀后转移至MWCNTs固相萃取小柱上，用10mL水淋洗，抽至近干后，用5．0mL乙腈洗脱，整个过程控制流速小于1mL／min，洗脱液于45℃下氮吹至干，加入1mL乙腈水溶液（2∶8，V／V）溶解，涡旋1min，过0．22μm微孔滤膜后，待UPLCMS／MS分析。

2 结果与讨论

2．1 色谱条件的优化

选择高效的色谱柱是多组分分析的前提条

件。本实验选用Waters公司的UPLC BEH C18（2．1mm×100mm×1．7μm）色谱柱分离青霉素类药物，此色谱柱对10种青霉素类药物具有较强的保留，各色谱峰能得到有效地分离，干扰较小。由于乙腈的离子化效率优于甲醇，本实验采用乙腈作为强洗脱流动相，用甲酸调节流动相溶液为pH 4．5，这可以有效改善峰形，提高离子化效率，且避免部分青霉素产生双峰，其总离子流图示于图1。

图1 10种青霉素类药物的总离子流图Fig．1 Total ion chromatogram of 10 penicillins

2．2 前处理方法的优化

本实验分别采用乙腈、甲醇、三氯乙酸、醋酸锌与亚铁氰化钾溶液（1∶1，V／V）沉淀牛奶中的蛋白质，比较其提取效果。虽然醋酸锌和亚铁氰化钾沉淀蛋白的效果很好，但部分青霉素类药物被沉淀物包裹，严重影响回收率。由于青霉素类药物在酸性条件下稳定性较差，故三氯乙酸不适合作为提取溶液。乙腈沉淀蛋白的能力较甲醇强，沉淀效果好，且易于分离，故采用乙腈作为提取溶剂。

牛奶成分复杂，通常采用固相萃取方式进行净化处理，由于提取溶剂极性强，直接过柱净化药物不能被保留，因此本实验分别考察了浓缩提取液后净化和稀释提取液后净化两种方式。结果表明：由于提取液中含有大量水，浓缩速度慢，部分目标化合物损失率大，而采用0．05mol／L磷酸缓冲溶液稀释提取液，使乙腈含量控制在5％左右，目标化合物在净化柱上都能得到保留。因此，本实验选择将提取液稀释后过柱。

2．3 净化条件的选择

多壁碳纳米管填料是影响净化效果的直接因素，为了保证萃取小柱填料的均匀性，减少萃取柱中气泡的产生，本实验采用湿法装柱。与干法装柱相比，多壁碳纳米管填料更紧密结实，净化效果较好。分别称取30、60、150mg多壁碳纳米管，以湿法方式装柱，考察不同柱容量的净化效果。结果表明：奶粉基质成分复杂，60mg填充量的除杂效果优于30mg填充量，且60mg填充量已完全满足分析的要求，故本实验采用60mg多壁碳纳米管以湿法填充萃取柱。

2．4 方法学验证

2．4．1 线性范围和定量限 本实验采用空白基质溶液配制系列浓度的标准溶液，以各分析物的峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x）为横坐标绘制基质标准曲线，10种青霉素类药物在各自的浓度范围内呈良好的线性关系，各药物的相关系数r均在0．99以上，以10倍信噪比（S／N＝10）计算10种青霉素类药物的最低定量限，结果列于表2。

表2 青霉素类药物的线性方程、相关系数和定量限Table 2 The linear equation，correlation coefficient and LOQs of penicillins

2．4．2 回收率和精密度 在阴性的牛奶样品中分别添加低、中、高3种不同浓度水平（青霉素V和甲氧苯青霉素的浓度分别为1、5、10μg／kg，其余青霉素的浓度分别为10、50、100μg／kg）的混合标准溶液，每个浓度做3次平行实验，按1．5方法进行预处理，青霉素类药物的回收率和相对标准偏差列于表3。

由表3可知，青霉素类药物的回收率为72．0％～110％，精密度为1．83％～9．33％，能满足日常检测的要求。

表3 青霉素类药物的回收率和相对标准偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations of penicillins

2．5 国家标准方法比较

在阴性的牛奶样品中添加青霉素混合标准溶液（青霉素V和甲氧苯青霉素的浓度为5μg／kg，其余青霉素的浓度为50μg／kg），分别进行3次平行实验，按照国家标准GB／T 21315—2007中的方法进行前处理，10种青霉素类药物的回收率为61．4％～84．1％，精密度为2．48％～12．4％。

国家标准所采用的前处理方法为乙腈水溶液提取，旋转蒸发去除高浓度的乙腈，但存在速度较慢，部分青霉素稳定性差，在前处理过程中容易损失和降解，造成回收率较低等问题。而本实验的前处理过程较国家标准简单，并采用内标法进行定量，实验结果更准确。此外，国家标准采用HLB固相萃取小柱对样品进行净化，价格昂贵、检测成本高。因此，采用改性后的多壁碳纳米管进行净化，不仅前处理简单，而且价格低廉，在一定程度上降低了检测成本。

3 结论

本实验建立了改性多壁碳纳米管固相萃取技术净化牛奶样品中青霉素类药物的分析方法，用酸将多壁碳纳米管材料表面羧酸化，处理后的材料纯度高，在溶液中分散均匀，净化效果更好。该方法的回收率为72．0％～110％，相对标准偏差为1．83％～9．33％。与国家标准GB／T 21315—2007相比，该方法具有前处理简单、操作成本低、回收率高、稳定性好等优点，适合日常样品的检测分析。

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Determination of Penicillin Residues in Milk by Multiwalled Carbon Nanotubes Cleaning and UPLC－MS／MS

CAO Hui1，2，CHEN Xiao－zhen1，ZHU Yan2，LI Zu－guang3，ZHU Ying1，ZHENG Jun－ke1

（1．Zhejiang Institute of Quality Inspection Science，Hangzhou310030，China；2．Department of Chemistry，Zhejiang University，Hangzhou310028，China；3．College of Chemical Engineering and Materials Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou310014，China）

A method was established for determining penicillin residues in milk by ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（UPLC－MS／MS）and multiwalled carbon nanotubes cleaning．The samples were extracted by acetonitrile and diluted by phosphate buffer solution，a step for clean－up and proconcentration of the analytes by solid phase extraction cartridge packed with multi－walled carbon nanotubes

multiwalled carbon nanotubes（MWCNTs）；solid phase extraction；ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（UPLC－MS／MS）；milk；penicillin

O 657．63

A

1004－2997（2015）01－0023－06

10．7538／zpxb．youxian．2014．0043

2014－01－05；

2014－04－07

科技部国家重大科学仪器设备开发专项（2012YQ09022903）；浙江省科技厅钱江人才科技计划项目（2010R10044）；浙江省质量技术监督系统科研计划项目（20110203）资助

曹 慧（1980—），女（汉族），浙江湖州人，高级工程师，从事色谱和质谱检测与科研工作。E－mail：ch＿zj＿cn＠163．com

陈小珍（1960—），女（汉族），浙江杭州人，教授级高级工程师，从事食品检测与研究工作。E－mail：cxz730＠163．com

时间：2014－08－20；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0043．html

（MWCNTs）．The target analytes were separated by Waters C18column with gradient elution using acetonitrile and 10mmol／L ammonium acetate（pH 4．5）as mobile phases．The analytes were detected by tandem quadrupole mass spectrometry after positive electrospray ionization by multiple reaction monitoring（MRM）．Internal standard method with matrix was used to determine the results．The correlation coefficient is greater than 0．99for each drugs．The limits of quantitation（LOQ）are 0．1－10．0μg／kg．The mean recoveries at the three spiked levels are 72．0％－110％．The relative standard deviations（RSDs）are 1．83％－9．33％．The results indicated that using multi－walled carbon nanotubes as solid phase extraction adsorbent is efficient for the purification．The simplicity，sensitivity and good precision of the method made it is well suitable for determination of penicillin residues in milk．