CD73在宫颈癌中的表达及临床意义

邢秀月

（海南省琼海市人民医院妇产科，海南 琼海 571400）

·临床论著·

CD73在宫颈癌中的表达及临床意义

邢秀月

（海南省琼海市人民医院妇产科，海南 琼海 571400）

目的探讨CD73在宫颈癌组织中的表达及临床价值。方法采用免疫组织化学法检测74例宫颈癌组织、49例宫颈上皮内瘤变（CIN）组织和74例正常宫颈上皮组织中CD73蛋白的表达，并分析其与宫颈癌患者临床病理参数的相关性。采用Western blot随机检测4例宫颈癌组织及自身对应正常宫颈上皮组织中CD73蛋白的表达。结果宫颈癌组织中CD73蛋白表达的阳性率显著高于CIN组织和正常宫颈上皮组织（P＜0.05）。CD73蛋白表达与宫颈癌患者年龄、组织学分化无关（P＞0.05），但与临床分期、浸润深度和淋巴结转移密切相关（P＜0.05）。Western blot检测表明，宫颈癌组织中CD73蛋白的表达显著高于正常宫颈上皮组织（P＜0.05）。结论CD73有望成为评价宫颈癌恶性程度和预后的指标。

CD73；宫颈癌；预后

1934年5-核苷酸酶（5’-nucleotidase，5’-NT）的活性首次在动物心脏和骨骼肌中被描述。目前，发现人体内有7种5’-NT，其中5种位于细胞质，1种位于线粒体基质，1种附着在质膜外，附着在质膜外的简称为eNT。1985年第四届国际人类自细胞分化抗原会议中eNT被正式命名为CD73。CD73广泛表达于人体多种组织细胞表面。近年来研究发现，CD73在肺癌、胰腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤组织中呈高表达[1]，在缺氧条件下，促使肿瘤微环境中腺苷聚积，从而发挥免疫抑制效应[2]。但是迄今为止尚未见任何关于CD73在宫颈癌中的研究报道。因此，本研究利用免疫组织化学法和Western blot检测宫颈癌组织中CD73蛋白的表达，并研究其可能的临床意义。本研究旨在为以CD73为分子靶点的宫颈癌的诊断和治疗提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1研究对象

选取2010～2012年本院手术切除的74例宫颈癌组织、49例宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neopiasia，CIN）组织和74例正常宫颈上皮组织标本，并经病理、组织学检查确诊。其中随机选取4例宫颈癌组织[经病理学诊断随机选取，2例为Ⅱa期（低分化），1例为Ⅰa1期（中分化），1例为Ⅰa2期（高分化）]和自身对应的正常宫颈上皮组织取样后液氮保存备用，行Western blot检测。所有患者术前未接受任何形式的治疗，包括放射治疗、化学治疗和免疫治疗。患者年龄25～73岁，中位年龄41岁；其中≥45岁50例，＜45岁24例。按2000年国际妇产科联合会（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期：Ⅰa期21例，Ⅰb1期19例，Ⅰb2期21例，Ⅱa期13例。组织学分级：高分化18例，中分化37例，低分化19例。宫颈癌标本中19例伴淋巴结转移。浸润深度：≤1/2层36例，＞1/2层28例，全层10例。

1.2免疫组织化学法

CD73鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz，免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法（streptavidin-perosidase）SP试剂盒和二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组织化学法染色步骤参照试剂盒说明书进行操作。CD73一抗稀释浓度为1∶50，以磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作为阴性对照，以已知的阳性宫颈癌切片为阳性对照组。

1.3结果评估

以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞，具体的判定方法依照参考文献[3]，即按照细胞着色强度和阳性细胞数作为评定方法，随机计数5个高倍镜视野，每例标本评价≥1000个细胞。染色强度：轻度着色1分，中度着色2分，强染色3分；阳性细胞＜10%为1分，阳性细胞10%～50%为2分，阳性细胞50%～80%为3分，≥80%为4分。将染色强度与阳性细胞数率相乘得到每例患者的染色总分，1～3分为阴性；4～12分为阳性。

1.4Western blot检测

将组织从液氮中取出，研磨后用组织蛋白裂解液提取总蛋白，然后将提取的总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）电泳。取下凝胶电转移到硝酸纤维素（nitrocellulose filter membrane，NC）膜上，用含5%脱脂奶粉的等渗盐溶液加Tris-HCl缓冲液封闭NC膜2h，加入一抗CD73 1∶100，4℃摇床孵育过夜，加入相应二抗室温孵育2 h，将NC膜置于增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂中反应1～3 min。暗室中利用X射线曝光，常规方法显影定影，显示特异的蛋白信号，蛋白表达的灰度值利用Image-Pro Pius 5.0软件进行分析。蛋白相对表达以目的基因与内参基因的比值β-actin作为内参照。每例样品做3次实验。

1.5统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计数资料以率表示，用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同宫颈组织中CD73蛋白的表达

免疫组织化学法检测74例宫颈癌组织、49例宫颈上皮内瘤变组织和74例正常宫颈上皮组织中CD73蛋白表达，结果显示，CD73蛋白主要定位于宫颈癌细胞的胞质中，呈浅黄色至棕黄色颗粒（见图1）。CD73蛋白在宫颈癌组织中表达的阳性率为79.7%，显著高于宫颈上皮内瘤变组织（36.7%）和正常宫颈上皮组织（10.8%），3组CD73蛋白的表达比较，差异有统计学意义（χ2=53.480，P＜0.01）（见表1）。

2.2CD73蛋白表达与临床病理学参数的相关性

CD73蛋白表达与宫颈癌患者的年龄和组织分化程度无关（P＞0.05），但与临床分期、浸润深度及淋巴结转移关系密切（P＜0.05）。见表2。

图1 CD73蛋白在不同宫颈组织中的表达

表1 CD73蛋白在宫颈癌、宫颈上皮内瘤变组织及正常宫颈上皮组织中的表达

表2 宫颈颈癌患者临床病理参数与CD73蛋白表达的相关性

2.3Western blot检测宫颈癌组织和正常宫颈上皮组织中CD73蛋白的表达

随机选取的4例宫颈癌组织中，CD73蛋白的表达显著高于对应的正常宫颈上皮组织（P＜0.05）。见图2。

图2 CD73蛋白在宫颈癌组织和正常宫颈上皮组织中的表达

3 讨论

研究表明，CD73在肿瘤的生长、凋亡、侵袭和转移中发挥重要作用。STAGG等[4]发现，CD73的活性在恶性程度较高的膀胱癌细胞中显著增高，证实嘌呤信号途径促进膀胱肿瘤的形成。ZHI等[5]通过体内外检测观察到转染CD73 siRNA的恶性乳腺癌细胞的生长和转移能力被明显抑制，表明CD73在体内外能促进肿瘤细胞的生长。同时WANG等[6]证实CD73还能通过腺苷促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移。最近研究发现，CD73表达上调的白血病T淋巴细胞能特异性地抑制人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导的凋亡，并诱导细胞产生多药耐药，从而促进肿瘤细胞的生存。肿瘤细胞CD73高表达与缺氧诱导因子（hypoxia-inducing factor，HIF）、Wnt/13-catenin信号异常、干扰素-α（Interferon-α，IFN-α）及腺苷有关。肿瘤组织内普遍缺氧，缺氧条件可诱导肿瘤细胞内HIF二聚体产生，该二聚体与CD73基因启动子中缺氧反应元件（hypoxia response element，HRE）结合，促进CD73基因的转录[7]。有研究发现，Wnt信号中的β-catenin可以通过转录因子T细胞因子-β（T-cell factor-β，TCF-β），作用于CD73基因的TCF/淋巴增强因子（lymphoid enhancing factor，LEF）结合位点，强烈增加CD73启动子的活性，促进基因转录[8]。研究发现，IFN-α能促进膀胱癌细胞CD73的表达。进一步研究显示，IFN-α通过间接地诱导其他调控介质来促进CD73基因转录[9-10]。有研究发现，腺苷通过激活瘤细胞表面腺苷受体，使细胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）增加，cAMP通过血肌酐结合蛋白与CD73基因的血肌酐结合，从而正反馈性调节CD73基因的转录[11]。本研究发现，雌二醇能够通过雌激素受体（estrogen receptor，ER）下调CD73基因表达。研究证实，ER是通过CD73基因启动子中的Sp-1和Ap-2结合位点间接下调CD73基因表达[12]。CD73在多种不同的肿瘤组织和细胞系中表达上调，表明其在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，但尚未见关于CD73在宫颈癌中的研究报道。

本研究通过分析74例宫颈癌组织、49例宫颈上皮内瘤变组织和74例正常宫颈上皮组织中CD73蛋白的表达,发现其CD73蛋白表达的阳性率分别为79.7%、36.7%和10.8%，3组CD73蛋白的表达比较差异有统计学意义（P＜0.05），提示宫颈癌中高表达的CD73可能与宫颈癌的发生、发展密切相关，该结果与CD73在其他肿瘤中的表达具有显著的一致性[4-6]。进一步研究发现，CD73蛋白表达与宫颈癌患者的年龄、组织分化程度无关（P＞0.05），但与临床分期、浸润深度及淋巴结转移的关系密切（P＜0.05）。利用免疫组织化学法了解CD73蛋白的表达和定位后，本实验采用更为灵敏的Western blot检测进一步证实宫癌组织中CD73蛋白的表达。本实验结果显示，宫颈癌组织中CD73蛋白的表达显著高于对应的正常宫颈上皮组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。更为重要的是，本实验在采用Western blot检测3号样品正常宫颈上皮组织时，未发现CD73蛋白的表达，该结果从某种程度上进一步验证免疫组织化学法检测的可靠性。

总之，本研究表明宫颈癌组织中存在高水平的CD73，其高表达与肿瘤的临床分期、浸润深度及淋巴结转移有关，但是其相关的分子机制尚需进一步探讨，有望为以CD73为靶点的宫颈癌基因治疗提供新的理论依据。

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[5]ZHI X,CHEN S,ZHOU P,et al.RNA interference of ecto-5'-nucleotidase(CD73)inhibits human breast cancer cell growth and invasion[J].Clin Exp Metastasis,2007,24(6):439-448.

[6]WANG L,ZHOU X,ZHOU T,et al.Ecto-5'-nucleotidase promotes invasion,migration and adhension of human breast cancer cells[J].J Cancer Res Clin Oncol,2008,134(3):365-372.

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[10]ZHI XL,CHEN SF,ZHOU P,et al.RNA interference of ecto-5'-nucleotidase(CD73)inhibits human breast cancer cell growth and invasion[J].Clinical Experimental Metastasis,2007, 24(6):439-448.

[11]ALLARD B,TURCOTTE M,STAGG J.CD73-generated adenosine:orchestrating the tumor-stroma interplay to promote cancer growth[J].Journal of Biomedicine and Biotechnology,2012,21(7): 1595-1602.

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（童颖丹 编辑）

Expression of CD73 protein in cervical carcinoma tissues and its clinical significance

Xiu－yue XING
(Department of Obstetrics and Gynecology,the Ppeople's Hospital of Qionghai City,Qionghai,Hainan 571400,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of CD73 in cervical carcinoma tissues and its clinical value.【Methods】Immunohistochemistry was used to detect the expression of CD73 in 74 cervical carcinoma tissues,49 cervical intraepithelial neoplasia(CIN)tissues and 74 normal cervical epithelial tissues.The relationships between the expression of CD73 and clinical pathological features were analyzed.The expression of CD73 in randomly selected 4 cervical carcinoma tissues and paired normal cervical epithelial tissues was detected by Western blot.【Results】The positive expression rate of CD73 protein in the cervical carcinoma tissues was significantly higher than that in the CIN tissues and normal cervical epithelial tissue and there were significantly differences among the 3 groups(P＜0.05).The expression of CD73 was not related to the age or histological differentiation(P＞0.05),but closely associated with clinical stage,invasive depth and lymph node metastasis(P＜0.05).Furthermore,Western blot results demonstrated that the level of CD73 in the cervical carcinoma tissues was markedly higher than that in the normal cervical epithelial tissue(P＜0.05).【Conclusion】CD73 may be an important molecular marker for evaluating malignant degree and prognosis of cervical carcinoma.

CD73;cervical carcinoma;prognosis

R737.33

A

1005-8982（2015）32-0055-04

2015-03-09