UPLC法测定白花蛇舌草注射液中对香豆酸的含量

汪晓娟，张亚中

(1.安徽省阜阳市人民医院，安徽 阜阳 236000;2.安徽省食品药品检验研究院，安徽合肥 230051)

白花蛇舌草注射液为白花蛇舌草经提取制成的单味药灭菌水溶液，用于湿热蕴毒所致的各种感染，亦可用于癌症辅助治疗。本次试验共收集到吉林省通化振国药业有限公司、安徽凤阳科苑有限公司和江西天施康中药股份有限公司的13批产品。现行标准收载于部标第十七册，标准内容包括性状、理化鉴别、TLC、pH及制剂通则检查、总黄酮含量测定。文献报道对香豆酸是其活性成分之一［1-3］，关于对香豆酸的测定一般采用普通高效液相色谱法测定［4-7］，但该方法分析时间较长，本文研究了用UPLC法测定白花蛇舌草注射液中对香豆酸的含量，方法简单，快速，分离度较好。

1 仪器与试药

超高效液相色谱仪(Waters公司);色谱柱:ACQUITY UPLCBEH C18柱(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)。

乙腈:Merck，色谱级;冰醋酸:Tedia，色谱级;纯净水为MILLI-Q纯水。

白花蛇舌草注射液:安徽凤阳科苑有限公司，批号:101129，110326，110325;吉林省通化振国药业有限公司，批号:110106，100907，110705，110704;江西天施康中药股份有限公司，批号:10110301，10010812，11010101，11031401，11020402，11051403。

对香豆酸对照品(批号11052132)，上海同田生化有限公司提供，含量为98.0%。

2 方法与结果

2.1 UPLC色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)，以 0.3%醋酸(A)—甲醇(B)为流动相，按表1进行梯度洗脱，柱温 20℃，流速 0.4 mL·min-1。

2.2 溶液制备 取对香豆酸对照品适量，精密称定，用50%甲醇制成每1 mL含20μg的溶液，作为对照品溶液。

精密量取白花蛇舌草注射液1 mL置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

表1 流动相梯度洗脱条件

2.3 方法学考察

2.3.1 吸收波长的选择 分别精密吸取上述溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，用PDA检测器进行全波段扫描，提取PDA扫描图谱，比较分析。结果显示:对香豆酸对照品溶液在308 nm波长处有最大吸收，因此选择308 nm作为测定波长。

2.3.2 系统适用性试验 (1)理论板数(n)的测定:取对照品溶液，注入液相色谱仪中，结果见图2，测得n=9 736，考虑到不同色谱柱之间的差异，将理论板数订为不得少于4 000。(2)精密度:精密量取对照品溶液，注入液相色谱仪，连续进样5次，其峰面积的测量值的相对标准偏差为0.4%(应≤2.0%)，符合药典规定。

2.3.3 专属性试验 按处方组成，取除白花蛇舌草药材的辅料，按供试品溶液制备项下的方法制备阴性对照溶液。在上述色谱条件下，阴性对照溶液无干扰，见图1。

2.3.4 标准曲线的制备和线性范围的考查 精密量取浓度为 16.78 mg·L-1的对照品溶液 0.1、0.2、0.4、1、2、4 μL 注入液相色谱仪，测定，以峰面积积分值为纵坐标，对香豆酸进样量(ng)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为 Y=293.39X+10.956(n=6，r=0.999 996)。结果表明:对香豆酸在1.678 ～67.12 ng范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.3.5 稳定性试验 取供试品溶液，在室温下放置，每隔一定时间后进样一次，进行测定，12 h内，峰面积的RSD为0.3%。结果表明:样品在12 h内稳定。

2.3.6 重复性试验 取样品(批号为10010812)6份，分别依法制成供试品溶液，测定对香豆酸的平均含量为0.17 g·L-1(RSD=0.3%)。结果表明:本法重现性良好。

2.3.7 准确度试验 取样品(批号为10010812)6份，每份 0.5 mL，精密加入浓度为 0.805 g·L-1的对照品溶液0.1 mL，依法制成供试品溶液，测定对香豆酸的含量，计算平均回收率为99.8%(RSD=0.7%)。本法准确度良好。

2.4 样品测定 取收集的样品13批，分别按正文方法测定对香豆酸的含量，结果见表2。

表2 含量测定结果

13批样品均检出了对香豆酸，但不同厂家的平均含量差异较大，安徽凤阳科苑药业有限公司、吉林省通化振国药业有限公司和江西天施康中药股份有限公司的平均值分别为0.047、0.353和0.228 g·L-1，13 批样品的平均含量为 0.224 g·L-1，这种差异可能与不同生产厂家的生产工艺不统一有关，因此暂订对香豆酸的含量为不少于0.224×(1-20%)=0.18 g·L-1为宜，建议各生产企业应尽快统一生产工艺，消除这种差异，以保证产品的有效性和均一性。

3 讨论

3.1 UPLC的色谱条件优化 课题组在前期的研究中采用HPLC，流动相为醋酸水溶液(pH3.2)—甲醇(95∶5)(A)—乙腈(B)系统，对香豆酸的出峰时间为35 min，全部色谱峰出完的时间为70 min，时间较长。后采用UPLC，考虑到HPLC的流动相体系较为复杂，流动相改用了0.3%醋酸(A)—甲醇(B)体系，两者的峰型较为类似，因此 UPLC采用了0.3%醋酸(A)—甲醇(B)体系。在UPLC测定研究中先采用了等度洗脱，对香豆酸可在5 min出峰，分离度良好，但其他色谱峰分离度较差，不符合指纹图谱的要求，考虑到整个质量标准还需建立指纹图谱，因此本文采用了梯度洗脱，既能满足指纹图谱的要求，也可用于含量测定。

3.2 超高效液相色谱的优点 超高效液相色谱(UPLC)［9］，与传统的 HPLC 技术相比，提供了更高的效率，因而具有更强的分离能力，在药物分析上正有越来越多的应用。本试验将高效液相色谱用于白花蛇舌草注射液的含量测定，与普通HPLC采用C18填料的色谱柱比较，其分析速度提高了5倍以上，且具有较高的分析通量。

3.3 白花蛇舌草注射液质量标准问题 白花蛇舌草注射液的现行标准较为简单，不能保证白花蛇舌草注射液的安全性和有效性，课题组已经对白花蛇舌草注射液进行了一些研究［10-12］，还有待进一步研究，为制定一个能体现白花蛇舌草注射液安全性和有效性的质量标准打下基础。

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