小麦胚芽油抗动脉粥样硬化的药效学研究

成利娟，葛朝亮，杨 翠，刘 铭，许杜娟，

(1.安徽医科大学药学院，安徽合肥 230032;2.安徽医科大学第一附属医院药剂科;3.安徽医科大学第一附属医院老年心内科，安徽合肥 230022)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种以动脉内膜有黄色粥样脂质积聚、血栓形成、纤维组织增生以及动脉中层钙化为特征的慢性进行性疾病，主要累及大中型动脉［1］。研究已证实严重的氧化应激可导致AS的发生发展。抗氧化成为AS治疗的重要方式之一。“全天然，低价位”的追求趋势使人们积极地发现并研究具有抗氧化活性的天然成分。小麦胚芽油(WGO)为禾本科植物小麦成熟种子的胚芽中提取的油酯，含有丰富的天然维生素E和亚油酸等多种人体必须的活性成分［2］。本实验组的前期研究表明，WGO能清除自由基，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的 酶比活力，降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，具有良好的体内外抗氧化活性。本研究在前期的基础上观察WGO对AS大鼠的治疗效果，并进一步探讨其抗AS的作用机制，为其在心血管疾病的预防用药及辅助治疗的开发应用方面提供实验依据及理论参考。

1 材料

1.1 动物 SD雄性大鼠70只，体重(200±20)g，SPF级，由安徽医科大学实验动物中心提供(皖动准字号SCXK2011－002)。

1.2 药品与试剂 小麦胚芽(安徽蒂王集团食品有限公司提供);大鼠血清前列环素(PGI2)试剂盒(武汉华美生物工程有限公司提供，CSBE13706r);血栓素A2(TXA2)试剂盒(武汉华美生物工程有限公司提供，CSB-E12689r);内皮素-1(ET-1)试剂盒(武汉华美生物工程有限公司提供，CSB-E06979r);阿托伐他汀片(辉瑞制药有限公司，批号:1237209);VD注射液(上海通用药业股份有限公司，批号:120812)。

1.3 仪器 CO2超临界萃取装置(杭州华黎泵业有限公司);GL20A全自动高速冷冻离心机(湖南仪器仪表总厂);UV-1600型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);MK3型酶标仪(美国赛默飞世尔公司);XW-80A涡旋混合器;OLYMPUS BX51显微镜(日本OLYMPUS公司);RM 2125型切片机(德国LEICA公司)。

2 方法

2.1 高脂乳剂的制备 水相:全脂奶粉120 g，食用盐8 g，丙二醇36 g，丙基硫氧嘧啶10 g，胆酸钠10 g，蔗糖200 g，水280 g，加热溶解制成水相;油相:猪油200 g，胆固醇100 g，吐温 80 36 g，加热溶解制成油相;水相加入油相搅拌相互溶解制成乳剂，冷却，加入维生素 0.8 g，矿物质 0.4 g，放入冰箱保存备用，灌胃前加热融化。

2.2 动脉粥样硬化大鼠模型的制备［3］健康雄性SD大鼠70只，取10只健康雄性SD大鼠作为正常组给予等量生理盐水。余下腹腔注射维生素D3(60 U·kg－1，分3 d注射)。其后开始灌胃给予高脂乳剂10 mL·kg－1，每日1次，建立AS大鼠模型。连续灌胃4周后，随机选择处理4只模型大鼠，观察主动脉弓内膜—中层厚度等血管病理状况，验证模型是否建立成功。

2.3 WGO的制备 将小麦胚芽颗粒过20目筛，去除细粉，称重800 g。超临界CO2萃取WGO，提取温度为45℃，压力为40 MPa，提取时间为180 min，CO2流量为15 kg·h－1，分离温度为50℃，分离压力为8 MPa。提取WGO 185 g，提取率为23.13%。提取出的WGO为亮黄色黏稠油状液体，无特殊气味，均匀，无沉淀。采用气相色谱进行质量分析:仪器:Agilent 6890NGC13，色谱柱:ZB-1(30 m × 0.25 mm×0.25μm)，进样口温度:300℃，检测器温度:300℃(FID)，柱温:250℃，载气:He，流速:2.4 mL·min－1，分流比:20∶1，进样体积:20 μL。检测结果，提取的WGO中生育酚总含量达0.27%，其中α-生育酚相对含量达73.1%。

2.4 实验动物分组及给药［4］将造模后的56只的大鼠进行分组，其中模型对照组10只，阳性药物组(8 mg·kg－1)10 只，WGO 高(2.0 g·kg－1)、中(1.0 g·kg－1)、低剂量(0.5 g·kg－1)各 12 只。灌胃给予WGO 8周，每天1次。除去造模后不正常进食及灌胃后损伤的大鼠，最终进行指标检测的大鼠为WGO高剂量组7只、中剂量组7只、低剂量组7只，阳性药物组7只，模型对照组7只，正常对照组6只(正常对照组给予相应蒸馏水)。

2.5 标本的采集 给药8周清晨空腹，用3.5%水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉，腹主动脉取血后，分离主动脉弓，纵行剪开，在10%中性福尔马林溶液中固定。血样低温离心取血清。生理盐水冲洗主动脉弓上的残血，取主动脉弓纵切面，石蜡包埋。

2.6 检测项目及方法

2.6.1 ELISA 法测定血清中 PGI2、TXA2、ET-1 的含量 按照试剂盒说明书进行操作。

2.6.2 主动脉形态学观察 固定24 h后的大鼠主动脉弓组织经脱水后石蜡包埋，连续冠状切片，厚度为3～4μm，每个组织连续切片15张，随机取出3张，HE染色，镜检。

3 结果

3.1 WGO 对 AS 大鼠血清中 PGI2、TXA2、ET-1含量的影响 与正常组相比，AS模型组大鼠血清中PGI2的含量显著降低(P ＜0.01)，TXA2、ET-1的含量均显著增加(P＜0.01)。AS大鼠连续WGO灌胃给药8周后，高、中剂量组血清PGI2含量明显增高(P ＜0.01，P ＜0.05)，TXA2、ET-1 含量均明显降低(P ＜0.01，P ＜0.05)，低剂量组 PGI2、TXA2、ET-1含量则未见明显改变(P＞0.05)。见图1～3。模型组TXA2/PGI2比值高于正常组，WGO灌胃给药8周后，该比值呈剂量依赖性降低。

3.2 WGO对AS大鼠主动脉弓形态学的影响正常组(A)大鼠主动脉弓形态正常，细胞层染色均匀，排列紧密而整齐。内皮细胞完整，单层紧贴内弹力板，中层平滑肌细胞排列整齐，呈长椭圆形，外膜为疏松结缔组织;模型组(B)大鼠主动脉弓血管形态明显改变，原有整齐层次分明的结构已完全消失，管壁明显增厚，内膜层泡沫细胞可达五六层，平滑肌增生明显，细胞排列紊乱，纤维组织增生伴片状或点状钙化，弹性纤维层结构不清，形成纤维增生性动脉粥样硬化斑块，斑块表面纤维帽薄，突出的斑块内含有坏死物质，平滑肌细胞减少，呈较典型的成熟动脉粥样硬化斑块;WGO高剂量组(E)大鼠主动脉弓血管形态基本完全趋于正常组(A)，细胞恢复正常层次，完整且排列紧密、均匀，中剂量组(D)与模型组(B)比较也有相应的改善，动脉粥样斑块已消失，细胞排列向着整齐均匀过渡，但仍有部分泡沫细胞;WGO低剂量组(C)对动脉粥样硬化的主动脉弓形态无明显的改善作用(见图4)。

4 讨论

心脑血管疾病成为世界范围内威胁人类健康的主要原因，无论冠心病还是脑卒中，他们共同的病理基础都是动脉粥样硬化。防治动脉粥样硬化，对预防心脑血管疾病有重要意义。寻求天然低毒的有效抗动脉粥样硬化药物是人们共同的目标。有“液体黄金”之称的WGO，富含亚油酸，又是天然维生素的优良载体，具有极高的保健、治疗价值。其药用价值亟待研究与开发。

AS是一种慢性、进行性、多发性血管内膜疾病，对本病的发病机制，有多种学说从不同角度来阐述，包括氧化应激学说、血栓形成学说、内皮损伤反应学说等［5－6］。活性氧参与炎症、脂质过氧化、衰老等多种病理损伤，氧自由基增加胞质内钙离子浓度，减少一氧化氮(NO)的生成，使血管舒张作用减弱。同时，钙离子内流消耗三磷酸腺苷(ATP)，使ATP减少。NO和ATP共同减少导致血管内皮受损;过度的氧化应激可促进炎症因子和黏附分子过表达进而损伤内皮细胞;同时还可通过氧化修饰的脂类引起AS的各种炎症效应［7］。因此抗氧化剂的应用在治疗AS中有重要意义，阻止低密度脂蛋白(LDL-C)氧化，改变高密度脂蛋白(HDL-C)的组成和活性，增加载脂蛋白的水平，有助于胆固醇的逆行转运，使动脉粥样硬化病变减轻，被称为具有应用前景的药物。本实验组的前期研究表明，WGO能清除自由基，提高 SOD、GSH-Px酶比活力，降低MDA含量，具有良好的体内外抗氧化活性，有望成为新的治疗AS的天然高效药物。

生物体内血栓形成过程中PGI2与TXA2是一对抗衡因子［8－10］。PGI2 可由血管内皮细胞、血管平滑肌细胞产生，是花生四烯酸连锁反应的最终产物，具有强力抗血小板凝集作用和血管扩张作用，能调节血管张力，对维持各种组织血流起重要作用。由血小板产生的TXA2可促进血小板聚集，血管收缩，促进凝血及血栓形成。文献报道及该实验结果均证实，动脉硬化病理下的血管合成PGI2减少，TXA2 增多，TXA2/PGI2 比例显著增高［11］。ET-1一种在心血管中起重要作用的内源性长效血管收缩调节因子。内皮细胞受到刺激合成并释放ET-1，与相应受体结合，诱导细胞内钙离子增高，从而发挥其缩血管作用，是迄今所知最强的缩血管物质。目前大量研究表明严重心绞痛、心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤的机体均伴有ET-1的过度表达［11］。该实验证实AS模型大鼠ET-1明显高于正常组，血管舒缩状态严重失衡，导致内皮损伤。

AS模型大鼠给予WGO后，TXA2/PGI2比值呈剂量依赖性降低，失衡状态得到明显改善，提示WGO可通过调节TXA2/PGI2平衡抑制血栓形成而防治AS。中、高剂量的WGO显著降低TXA2、ET-1的含量，明显提高PGI2，通过调节血管舒缩状态平衡而修复损伤的内皮。病理结果提示WGO可能参与调节平滑肌细胞的增殖途径，抑制泡沫细胞的形成等机制逆转、改善动脉粥样硬化进程［12－13］。

本实验表明WGO能明显逆转AS大鼠的动脉粥样硬化状态，对于动脉粥样硬化的防治起到重要作用。其作用机制可能涉及抗氧化、抑制血栓形成、保护血管内皮等多方面。但目前对于WGO的研究尚集中在提取方法的研究，对其药效学及作用机制的研究鲜有报道。文中有关WGO治疗AS的研究仍是初步的，更全面、完善的药效及作用机制有待于进一步的探索和研究，为其在心血管疾病的预防用药及辅助治疗的开发应用方面提供实验依据及理论参考。

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