复方九节茶乳膏的质量标准研究

李 杰，欧余航，陈 强

(1.中国人民解放军第175医院，福建漳州 363000;2.福建中医药大学药学院，福建福州 350122)

复方九节茶乳膏是由九节茶和冰片配伍制成的外用乳膏剂，具有消炎止痛的功效。方中九节茶为金粟兰科植物草珊瑚(Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai)的干燥地上部分［1］。其味辛、苦，功专清热解毒，活血散瘀通络，为君药;配以冰片清热消肿止痛［2］，又能促透皮吸收;二药合用共奏“舒筋活血、消肿止痛”之功。草珊瑚属植物中的香豆素类(如异嗪皮啶)具有消炎、止痛等活性［3－5］，采用薄层色谱法对异嗪皮啶进行定性鉴别;有机酸是中草药抗菌消炎活性成分［6－11］，以反丁烯二酸和迷迭香酸为指标成分，采用高效液相色谱法建立其含量测定方法［12－14］;方中另一味主药冰片采用薄层色谱法对其定性鉴别，旨在建立有效的可控制该制剂质量的方法。

1 材料与试剂

Waters高效液相色谱仪(PDA检测器，美国Waters公司)、XS105电子分析天平(METTLER TOLEDO公司)、CP214电子天平(奥豪斯仪器有限公司)、1-14离心机(德国 sigma)、TDL-80-2B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、DK-S22型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)、数控超声波提取器(济宁天华超声电子仪器有限公司)、Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)、薄层硅胶G板。

复方九节茶乳膏(批号:20120814、20120815、20120816)、乳膏基质(自制)、乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 鉴别

2.1.1 九节茶鉴别 取复方九节茶乳膏1 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20 mL，超声30 min溶解，冰浴2 h，离心30 min，取上清液，浓缩至约1 mL，作为供试品溶液。按处方组成，取除九节茶浸膏外的其余药味与基质按复方九节茶乳膏工艺条件制备阴性样品，依供试品溶液的制备方法操作，制得阴性对照溶液。再取九节茶浸膏约0.1 g，加水10 mL，超声处理30 min，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为九节茶浸膏溶液。另取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(2010版药典一部附录ⅥB)试验，吸取上述4种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯—乙酸乙酯—甲酸(9∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。结果见图1。

2.1.2 冰片鉴别 取复方九节茶乳膏约1 g，置具塞试管中，加入无水乙醇8 mL，水浴50℃，溶解，冰浴 30 min，离心(3 500 r·min－1)15 min，取上清液，备用;取冰片对照品加入无水乙醇制成浓度为2 g·L－1的溶液，作为对照品溶液;取九节茶乳膏(不含冰片)，依供试品溶液的制备方法操作，制得阴性对照溶液。照薄层色谱法(2010版药典一部附录ⅥB)试验，吸取上述3种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上。展开剂为石油醚(30～60℃)—乙酸乙酯(9∶1)，展开，取出，晾干。喷以1%香草醛硫酸溶液，105℃烘至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。结果见图2。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 采用Kromasil C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱温30℃，以流动相0.1%甲酸乙腈溶液(B)—0.1%甲酸水溶液(D)进行梯度洗脱［0～10 min，5%B→20%B;10 ～25 min，20%B;25 ～30 min，20%B→5%B;30 ～35 min，5%B］，流速为1.0 mL·min－1，检测波长为210 nm和330 nm，理论板数按迷迭香酸计算应不低于5 000。

2.2.2 溶液制备 (1)对照品溶液的制备:分别精密称定反丁烯二酸、迷迭香酸对照品8.16 mg和10.66 mg，置25 mL量瓶中，加60%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。

(2)供试品溶液的制备:取本品约0.25 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇15 mL，称重，然后于50℃水浴超声30 min，冷却至室温，用60%甲醇补足失重，冰浴1 h，离心(12 000 r·min－1，15 min)，过0.22 μm 滤膜，取续滤液作为供试品溶液。精密量取对照品溶液与供试品溶液各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图。

(3)阴性对照品溶液的制备:按处方组成，取除九节茶浸膏外的其余药味按复方九节茶乳膏工艺条件制备阴性样品，依(2)供试品溶液的制备方法操作，制得阴性对照溶液。

2.2.3 HPLC 的测定 按照“2.2.1”色谱条件，分析反丁烯二酸和迷迭香酸对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，结果见图3～8。

2.2.4 线性范围 分别精密吸取上述反丁烯二酸储备液0.2、0.3、0.5、1、2 mL，分别置10 mL 容量瓶中，并吸取上述迷迭香酸储备液 0.1、0.2、0.3、0.5、1 mL依次置上述10 mL容量瓶中，加60%甲醇稀释至刻度，摇匀，依法测定。以峰面积A和浓度C绘制标准曲线，得迷迭香酸回归方程:A=56 006C－81 204，r=0.999 5，反丁烯二酸回归方程:A=104 483C －24 981，r=0.999 9，迷迭香酸、反丁烯二酸分别在 4.26 ～42.64 mg·L－1、6.53 ～65.28 mg·L－1浓度范围内呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.2(1)”项下迷迭香酸对照品溶液0.5 mL和反丁烯二酸对照品1 mL，置10 mL容量瓶中，加60%甲醇定容至刻度，摇匀，进样，每次进样20μL，连续进样6次，测得迷迭香酸的峰面积平均值为1 092 289，RSD=0.26%，反丁烯二酸峰面积的平均值为3 436 871，RSD=0.35%，说明该方法精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取同一批号样品，配制6份，依“2.2.1”项下方法测定，计算得反丁烯二酸平均含量为1 417.35μg·g－1，RSD=1.35%(n=6)，迷迭香酸平均含量为 829.51 μg·g－1，RSD=1.26%(n=6)。

2.2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，于0、2、4、6、8、12 h测定，得反丁烯二酸的峰面积平均值为2 526 141，RSD=0.73%(n=6)，迷迭香酸的峰面积平均值为 704 233，RSD=1.09%(n=6)，溶液在12 h内稳定。

2.2.8 加样回收率试验 取本品约0.125 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，再精密移取迷迭香酸对照溶液0.3 mL，反丁烯二酸对照溶液0.6 mL，加60%甲醇至15 mL，称重，然后于50℃超声水浴中超声30 min，冷却至室温，用溶剂补足失重，冰浴60 min，离心(12 000 r·min－1，15 min)，过 0.22 μm 滤膜，取续滤液20μL进样。按“2.2.1”项下方法测定，结果见表1。

2.2.9 样品测定 取本品，按“2.2.2(2)”项下方法配制供试品溶液，依法测定。结果见表2。

3 讨论

为确保乳膏中有效成分含量测定的准确性，首先要保证有效物质的溶出，就是要使乳膏充分破乳，并给予足够长时间的冰浴，尽量减少基质的干扰。在相同的前处理的条件下，考察了不同浓度的甲醇(60%、70%、90%)对乳膏中指标性成分反丁烯二酸和迷迭香酸的提取效果。由于反丁烯二酸的极性相对较大，60%甲醇对其溶出效果明显优于90%甲醇，且含量差异较大;迷迭香酸的极性相对小些，但不同浓度的甲醇对其溶出效果差异不是很大，结果综合考虑两种指标性成分的提取率，最终确定以60%作为提取溶剂。不同提取溶剂的用量的考察(5、10、15 mL)，最终确定为15 mL。考察不同提取时间，超声时间为15、30、45 min，最终确定为30 min。

表1 回收率测定结果

表2 三批试制产品含量检测结果

在测定波长选择时，首先对两种指标性成分分别进行全波长扫描结果，反丁烯二酸只在210 nm处有最大吸收，迷迭香酸在330 nm处有最大吸收，为更准确测定各自的含量，因此借助仪器的DAD检测器，双波长法测定二者的含量。

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