梅毒螺旋体传代接种对兔梅毒模型RPR滴度的影响

于瑞星 尹跃平韩 燕 钟铭英 施美琴 王 琪 龚匡隆

梅毒螺旋体传代接种对兔梅毒模型RPR滴度的影响

于瑞星 尹跃平∗韩 燕 钟铭英 施美琴 王 琪 龚匡隆

目的: 明确兔睾丸组织中Tp Nichols菌株传代接种对实验兔血清学滴度的影响。方法:按照接种Tp菌株代数的不同，将23只家兔分为原代组(5只)、一代组(9只)、二代组(8只)，空白对照组(1只)。原代组所接种菌株为保存于液氮的Tp Nichols复苏菌株；一代组实验兔所接种菌株来自于原代组实验兔肿大睾丸；二代组实验兔所接种菌株来自于一代组实验兔肿大睾丸。接种14天后抽取兔耳缘静脉血并空气注射致死，对兔的耳缘静脉血清进行RPR和TPPA检测。结果: 接种后实验兔全部感染。原代组、一代、二代组RPR滴度≥1∶16的兔比例分别为20%，88.9%，100%，原代组与一代、二代组比较差异均有统计学意义(P＝0.008；P＝0.001)，一代组与二代组比较，差异无统计学差异(P＝0.249)。RPR几何平均滴度在原代组、一代组、二代组分别为4.0，25.4，76.1，原代组与一代组、二代组间比较，差异有统计学差异(P＜0.05)，一代与二代组间比较差异无统计学差异(P＞0.05)。结论:在建立梅毒兔实验模型时，将液氮中保存的Tp Nichols菌株在睾丸组织中传代接种，可提高实验兔的梅毒血清学滴度。

梅毒螺旋体； 新西兰雄兔； 感染模型

梅毒是最常见的性传播疾病之一，据WHO估计全球每年新发梅毒患者约1060万例，1梅毒发病人数居乙类传染病的第三位。目前还没有预防控制梅毒的疫苗，有效的抗生素治疗是预防控制梅毒的重要措施之一。青霉素是治疗梅毒的一线药物，但据报道一般人群青霉素过敏率为8%～28.1%。2，3头孢曲松是治疗梅毒的替代方案之一，但是目前有关头孢曲松治疗梅毒的药物动力学等研究尚未明确。建立标准的兔梅毒感染模型是研究头孢曲松等药物治疗梅毒机制的重要前提。根据文献报道，4在人体治疗梅毒血清学滴度下降4个单位才能称为治疗有效，如果在兔感染模型中RPR滴度低于1∶16，则给予感染的兔梅毒注射头孢曲松后，RPR滴度变化幅度较小，不易评价头孢曲松药治疗梅毒的疗效。本文的研究目的是观

察通过接种14天后取睾丸中传代培养的Tp Nichols菌株立即再次接种是否能够提高实验兔血清滴度抗体，为建立梅毒抗菌药物的药效评价模型奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 新西兰雄兔购于江苏省金陵种兔厂，Tp Nichols标准株(美国华盛顿大学过敏与传染病实验室惠赠)；无菌生理盐水；RPR试剂购于上海科华生物工程股份有限公司，TPPA试剂购于珠海丽珠股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液制备 将液氮中低温保存的Nichols标准株在37℃的培养箱中复苏1 h，置于装有15 mL无菌生理盐水的烧瓶中剪碎后静置15 min，取一定量的菌悬液于载玻片上，盖上盖玻片，置于暗视野显微镜下计数，制备一定浓度的菌悬液(约含梅毒螺旋体107/m L)。

1.2.2 睾丸接种 按照接种Tp菌株代数的不同，将23只实验兔分为原代组(5只)、一代组(9只)、二代组(8只)，健康对照组(1只)。原代组实验兔所接种菌株为保存于液氮的Nichols复苏菌株；一代组实验兔所接种菌株来自于原代组实验兔肿大睾丸；二代组实验兔所接种菌株来自于一代组实验兔肿大睾丸。具体步骤如下:取体重3.0～3.5 kg的新西兰雄兔，将其固定在兔实验台上，挤压腹部，使其睾丸通过腹压膨胀，用无菌棉球消毒后，将2 mL菌悬液分别注射致两侧睾丸，14天后取实验兔耳缘静脉血并空气注射致死。

1.2.3 菌株保存 将处死的实验兔固定于实验台上，用酒精棉球消毒后静置1～3 min待酒精挥发，切开筋膜取出睾丸，置于装有15 mL无菌生理盐水烧瓶中，剪碎睾丸后静置5min，吸取少量菌悬液至载玻片，盖上盖玻片，在暗视野显微镜下观察计数螺旋体，制备一定浓度的菌悬液(约含梅毒螺旋体107/mL)，将2 m L菌悬液注射至一代组两侧睾丸。取出其他肿大的兔睾丸，放置于液氮保存管中，用纱布包扎并标记。4℃保存2 h后转移至－20℃保存2～3 h后转移至－70℃冰箱过夜保存，于次日保存于液氮罐中。

1.2.4 TPPA和RPR检测 按标准方法进行TPPA和RPR检测。5

2 统计学方法

对RPR滴度的倒数进行对数转换后计算几何平均滴度及95%CI。计数资料用t检验，计量资料用χ2检验。

3 实验结果

表1 实验兔接种时间、RPR滴度及TPPA实验结果

表2 三代兔睾丸肿大、TPPA(＋)、RPR(≥1∶16)例数比较

见表1。其中1只实验兔作为健康对照，其睾丸无肿大、RPR(－)、TPPA(－)。22只实验兔全部感染Tp。原代、一代、二代组间RPR滴度≥1∶16的实验兔比例差异有统计学意义(χ2＝12.299，P＝0.002)，见表2。原代组与一代、二代组相比，其RPR滴度≥1∶16的兔比例较低(χ2＝6.966，P＝0.008；χ2＝11.044，P＝0.001)；一代组RPR滴度≥1∶16的兔比例与二代组无统计学差异(χ2＝1.327，P＝0.249)。RPR几何平均滴度在原代组与一代组、原代组与二代组间有统计学差异(P＜0.05)。一代组与二代组之间RPR几何平均滴度无统计学差异(P＞0.05)。

4 讨论

上个世纪20年代初期就开始进行梅毒的动物模型研究。在家兔中可形成实验性梅毒感染，一般认为Tp在家兔的实验感染和人的自然感染有相似之处。6仓鼠和豚鼠可在接种Tp部位发生损害但不典型；免疫受到抑制的鼠也可被感染，但不易成功。有研究表明，鼠对Tp的免疫反应较家兔慢，甚至难以产生兔免疫反应。7考虑到家兔对Tp的易感性，绝大多数建立的梅毒动物模型主要还是兔感染模型。8－11

在本文中，全部实验兔在接种14天后感染Tp，说明利用本实验方法可以成功建立实验兔梅毒感染模型。据文献报道，实验兔接种Tp后一般14天左右睾丸肿大，经暗视野显微镜观察Tp计数最多。所以在本研究中，接种14天后抽血检测其血清学滴度，并致死实验兔，取睾丸组织再次接种。根据文献报道，在人体治疗梅毒血清学下降4个滴度才可称为治疗有效。4原代组实验兔在接种Tp Nichols 14天后RPR几何平均滴度较低，说明在液氮中保存的复苏菌株感染实验兔14天后不宜进行药效学评价实验。一代、二代组实验兔RPR滴度差异无统计学意义，且两组RPR几何平均滴度较高，说明接种14天后取睾丸中传代培养的Tp Nichols菌株立即再次接种能够提高实验兔血清抗体滴度，且建立的兔梅毒感染模型更适合药效学评价。当然本文存在一定的局限性:(1)本实验在实验兔接种14天后没有进行后续观察，RPR滴度随着时间延长可能会继续上升，RPR滴度在第14天不一定达到最高值；(2)因实验兔为体重3.0～3.5 kg的新西兰雄性健康兔，仅随机抽取1只实验兔抽血进行TPPA和RPR实验排除梅毒感染的可能。

1 Daskalakis D.Syphilis:continuing public health and diagnostic challenges.Curr HIV/AIDSRep，2008，5(2):72－77.

2Macy E.Penicillin and beta－lactam allergy:epidemiology and diagnosis.Curr Allergy Asthma Rep，2014，14:476.

3Khasawneh FA，Slaton MA，Katzen SL，et al.The prevalence and reliability of self－reported penicillin allergy in a community hospital.Int JGen Med，2013，6:905－909.

4王千秋，刘全忠，徐金华，等.性传播疾病临床诊疗与防治指南.上海:上海科学技术出版社，2014.86－87.

5尹跃平.性病防治培训手册—实验室检测.北京:人民卫生出版社，2011.17－25.

6 Lukehart SA，Marra CM.Isolation and laboratorymaintenance of Treponema pallidum.Curr Protoc Microbiol，2007，12:12A.1.

7Saunders JM，Folds JD.Humoral response of themouse to Treponema pallidum.Genitourin Med，1985，61(4):221－229.

8 Zhao F，Liu S，Zhang X，etal.CpG adjuvantenhances themucosal immunogenicity and efficacy of a Treponema pallidum DNA vaccine in rabbits.Hum Vaccin Immunother，2013，9(4):753－760.

9 ZobaníkováM，Mikolka P，CejkováD，et al.Complete genome sequence of Treponema pallidum strain DAL－1.Stand Genomic Sci，2012，7(1):12－21.

10 Fitzgerald TJ.Effects of cefetamet(Ro 15－8074)on Treponema pallidum and experimental syphilis.Antimicrob Agents Chemother，1992，36(3):598－602.

11 Lukehart SA，Baker－Zander SA，Holmes KK.Efficacy of aztreonam in treatment of experimental syphilis in rabbits.Antimicrob Agents Chemother，1984，25(3):390－391.

(收稿:2014－08－05 修回:2014－12－07)

Effect of Treponema pallidum continuous passage inoculation in rabbitsmodel on RPR titer

YU Rui-xing，YIN Yue-ping，HAN Yan，et al.Institute ofDermatology，Chinese Academy ofMedical Sciences，Nanjing，210042

Objective:To determine the effectof Treponema pallidum(Tp)of continuous passage inoculation in rabbits on RPR titer.M ethods:Twenty three New Zealand male rabbitswere divided into the primary group(5 rabbits)，the first generation group(9 rabbits)，the second generation group(8 rabbits)and the blank control group(1 rabbit).In the primary group，the testicles of rabbits were inoculated with Nichols strains stored in liquid nitrogen container.In the first generation group，the testicles of rabbitswere inoculated with the strains from the rabbits of the primary generation group.In the second generation group，the testicles of rabbitswere inoculated with the strains from the rabbits of the first generation group.The levels of RPR and TPPA in blood sera from earmargin veinswere detected after 14 days of the inoculation.Results:All the inoculated rabbitswere infected by Tp.The rates of the rabbitswith RPR titermore than or equal to 1∶16 in the primary group，the first generation group and the second generation group were 20%，88.9%and 100%.And the RPR geometricalmean in the primary group，the first generation group and the second generation group were 4.0，25.4 and 76.1.Conclusion:The serum titers of Tp increased in rabbits of continuous passage inoculation.

Treponema pallidum；New Zealand male rabbit；infection model

国家十一五“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项“防治性病对预防艾滋病的作用研究”(编号: 2008ZX10001－005)

中国医学科学院皮肤病研究所，南京，210042∗通信作者