凋亡相关蛋白在扁平苔藓中的表达

葛 晶王 君赵 涵王桂芝

凋亡相关蛋白在扁平苔藓中的表达

葛 晶1王 君2∗赵 涵2王桂芝2

目的: 检测扁平苔藓皮损中核因子κB(NF－κB)和凋亡诱导因子(AIF)的表达。方法:采用免疫组化法和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记技术检测25例扁平苔藓患者皮损和25例健康皮肤组织中AIF和NF－κB的积分光密度值(IOD)和角质形成细胞的凋亡指数(AI)。结果: 扁平苔藓组NF－κB和AIF的积分光密度值均高于健康对照组(P＜0.01)，扁平苔藓中角质形成细胞的凋亡指数显著高于健康对照组，两组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。NF－κB的阳性表达强度与自身角质形成细胞的凋亡指数不存在相关性(r＝0.13，P＞0.05)，扁平苔藓组AIF的阳性表达强度与其自身的角质形成细胞的凋亡指数呈正相关(r＝0.64，P＜0.01)。结论: AIF可能参与了扁平苔藓角质形成细胞的细胞凋亡。

扁平苔藓； NF－κB； AIF； 免疫组化； 细胞凋亡

NF－κB是具有多向转录调节作用的细胞核蛋白因子，不仅与细胞凋亡关系密切，而且与肿瘤形成有关。NF－κB在长期的免疫和炎症反应中起到至关重要的作用，可通过结合和编码免疫和炎症区域的启动子来影响目的基因的转录，从而影响细胞的增殖和凋亡。1曾有学者研究，在口腔扁平苔藓皮损中，NF－κB在基底层和棘层的角质形成细胞胞核中表达。2细胞凋亡分为外源性途径和内源性途径。半胱天冬氨酸蛋白酶－3(caspase－3)是外源性途径引起细胞凋亡的最终执行因子，已有大量的研究表明caspase－3参与了扁平苔藓的形成。凋亡诱导因子(AIF)参与内源性线粒体途径引起细胞凋亡。3当细胞接收到凋亡信号后，存在于线粒体中的AIF被蛋白酶切断后转移到细胞质和细胞核中，进而引起染色质凝集和DNA断裂，导致细胞凋亡。3目前关于NF－κB和AIF在扁平苔藓中的表达及其与凋亡的相关性研究较少，本研究旨在通过免疫组化方法检测扁平苔藓中NF－κB和AIF的表达情况，并检测扁平苔藓的凋亡指数，探讨其在扁平苔藓发病中可能存在的作用及与细胞凋亡的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集青岛大学附属医院皮肤科2011年7月至2014年2月的扁平苔藓患者皮损石蜡标本25例，其中男15例，女10例。年龄31～45岁，平均37.5岁，皮损12例位于躯干，13例位于四肢，病程1～3个月。所有标本均经临床医师和专业病理医师确诊为扁平苔藓。另取整形美容术后健康人皮肤组织25例，其中男12例，女13例，皮损11例位于躯干，14例位于四肢。年龄26～54岁，平均36岁。两组性别、年龄及皮损取材部位差异均无统计学意义。

1.2 试剂 兔抗人NF－κB多克隆抗体，兔抗人AIF多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；通用型二抗pv－6001(北京中杉金桥)；二氨基联苯胺(DAB)试剂(北京中杉金桥)，TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(凯基生物公司)，免疫组化笔(中杉金桥)。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化 将石蜡标本切成3μm厚的切片；64℃烘烤1 h；切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇至水；用PH为6.0柠檬酸盐缓冲液高压修复2min；3%过氧化氢10 min消除内源性过氧化物酶活性。分别滴加一抗NF－κB和AIF(滴度均为1∶70)，37℃水浴1 h，滴加通用型二抗pv－6001，37℃水浴30 min；DAB显色1 min 15 s，苏木素复染，脱水封片。所有步骤均用磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)冲洗3次，每次5 min。用磷酸盐缓冲液代替一抗做阴性对照。

1.3.2 TUNEL 石蜡切片按常规方法脱蜡水合，3%过氧化氢封闭10 min，Proteinase K 37℃通透反应30 min，DNaseI37℃处理30min，分别配制脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT酶)液避光反应60 min，荧光素标记链酶亲和素抗体反应液和转化剂过氧化物酶(POD)各避光反应30 min，DAB显色，苏木素复染，脱水封片。

1.4 结果判定

1.4.1 免疫组化 NF－κB和AIF阳性细胞表现为细胞核或细胞质被染成棕黄色，采用Image－Pro Plus6.0图像分析系统对扁平苔藓和对照组的切片进行定量分析，测出其积分光密度值(integrated optical density，IOD)，用来表达每张切片的阳性强度。每张切片选取5个阳性较强的高倍视野(×400)，取其平均值。

1.4.2 TUNEL 凋亡细胞的细胞核被染成棕色或棕黄色。凋亡指数(apoptosis index，AI)的计算:每个标本选取5个阳性高倍视野(×400)，计算出角质形成细胞的阳性细胞数所占总细胞数的百分比，其平均值为AI。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件，免疫组化和TUNEL的组间比较采用t检验；NF－κB和AIF的表达强度与其角质形成细胞间的凋亡指数的相关性分析采用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果 在扁平苔藓皮损中NF－κB和AIF阳性染色主要定位于基底层和棘层的角质形成细胞和真皮乳头层的淋巴细胞中，定位于胞质和(或)胞核中，NF－κB在真皮乳头层的淋巴细胞中表达显著。而在健康对照组中仅在基底层中角质形成细胞胞质中呈部分阳性表达并且着色较浅。部分健康人呈阴性表达。扁平苔藓皮损中NF－κB和AIF的表达与对照组之间的差异均具有统计学意义(P＜0.01) (表1，图1)。

2.2 凋亡检测结果 扁平苔藓皮损中角质形成细胞的细胞核着棕黄色为凋亡细胞，主要位于棘层和基底层。而健康人皮肤组织中凋亡细胞明显减少。扁平苔藓组和健康对照组的AI分别为41.55±23.04和17.54±7.20，两者差异具有统计学意义(t＝4.97，P＜0.01)(表1，图1)。

图1 扁平苔藓皮损及正常对照皮肤免疫组化

表1 扁平苔藓组和健康对照组中NF－κB和AIF的积分光密度值(IOD)和细胞凋亡指数

2.3 相关性分析 扁平苔藓皮损中NF－κB的阳性表达强度与自身角质形成细胞的凋亡指数不存在相关性(r＝0.13，P＞0.05)，扁平苔藓皮损中AIF的阳性表达强度与其自身的角质形成细胞的凋亡指数呈正相关(r＝0.64，P＜0.01)。

3 讨论

细胞凋亡亢进是扁平苔藓的重要形态学特征。Green曾研究表明细胞凋亡的两条主要通路线粒体依赖性途径和死亡受体途径并非完全各行其道，而是在caspase－3处会合并通过caspase－3激活下游底物而呈现凋亡细胞的共同特点。4Abdel－Latif等5曾研究表明扁平苔藓是依赖caspase的凋亡途径引起细胞凋亡，但是我们的研究表明扁平苔藓也可以依赖线粒体凋亡途径引发细胞凋亡。在本次研究中NF－κB和AIF在扁平苔藓的基底层和棘层中均有表达，且AIF的表达情况与其自身的角质形成细胞的凋亡指数呈正相关，由此可以推断出AIF可能参与了扁平苔藓的凋亡过程。而NF－κB在扁平苔藓真皮乳头层的淋巴细胞中仍有大量表达，表明NF－κB还可能参与了扁平苔藓的免疫炎症反应。

扁平苔藓是一种T细胞介导的针对上皮细胞的免疫反应，导致T细胞的持续累积和上皮细胞的损伤。在以往的免疫组化实验中，NF－κB用于检测组织中不同形式的慢性炎症。非活化的NF－κB是以与IκB(κB抑制蛋白)聚合的三聚体形式存在胞浆中，当机体受到刺激时，IκB激酶被激活，从而导致IκB蛋白磷酸化，泛素化，然后被降解，NF－κB二聚体得到释放。NF－κB可以转移到细胞核中发挥基因转录调控的作用，促进多种与免疫相关细胞因子的释放，导致炎症级联反应的发生。6NF－κB参与很多癌症的发生和发展，例如Giopanou等7在卵巢癌组织的上皮细胞中检测到NF－κB的存在。NF－κB在肿瘤的不同发展阶段有不同的作用，在G1期具有抑制细胞周期进程，促进细胞增殖的作用，而在NGM－4IM阶段中，NF－κB可促进细胞凋亡和增殖。近年来，以NF－κB为药物作用的靶向点，通过调节NF－κB的活性影响细胞的增殖或凋亡，来治疗口腔扁平苔藓已经得到广泛关注。8但是对于皮肤扁平苔藓来说，对于针对NF－κB的药物治疗还需进一步研究。

AIF是Susin等发现具有促凋亡活性的蛋白，其诱导非caspase依赖的细胞凋亡，AIF位于线粒体膜间隙，既具有细胞凋亡活性又具有氧化还原酶活性，但二者的作用是解偶联的。9当细胞被诱导凋亡，AIF裂解钙蛋白酶然后从线粒体转运到细胞质和细胞核，在核中与染色体结合，导致非caspase依赖的染色质凝聚，并断裂成约50 kb的大片段，从而引起细胞凋亡。10有大量的证据表明AIF作为一种线粒体蛋白参与肿瘤细胞的凋亡过程，其中Fan等经研究表明AIF与食管鳞状细胞癌的发生密切相关。11Jeong等研究发现在大肠癌组织中AIF的表达强度远远高于正常组织。12AIF也在胃癌等其他癌症的发展中发挥作用，但是AIF与扁平苔鲜的相关性研究未见报道。本研究表明，AIF可能参与了扁平苔藓皮损中凋亡细胞的形成。

1 Santoro A，Majorana A，Bardellini E，et al.NF－κB expression in oral and cutaneous lichen planus.JPathol，2003，201:466－472.

2 Zhou G，Xia K，Du GF.Activation of nuclear factor－kappa B correlateswith tumor necrosis factor－alpha in oral lichen planus: a clinicopathologic study in atrophic－erosive and reticular form. JOral Pathol Med，2009，38:559－564.

3 Yuste VJ，Moubarak RE，Delettre C，et al.Cysteine protease inhibition prevents mitochondrial apoptosis inducing factor (AIF)release.Cell Death Differ，2005，12:1445－1448.

4Green DR.Apoptosis pathways paper wraps stone bluts scissor. Cell，2000，102:224－227.

5Abdel－Latif AM，Abuel－Ela HA，EI－Shourbagy SH.Increased caspase－3 and altered expression of apoptosis－associated proteins，Bcl－2 and Bax in lichen planus.Clin Exp Dermatol，2009，34(3):390－395.

6Wullaert A，Bonnet MC，Pasparakis M.NF－κB in the regulation of epithelial homeostasis and inflammation.Cell Res，2011，21(1):146－158.

7 Giopanou I，Bravou V，Papanastasopoulos P，et al.Metadherin，p50，and p65 expression in epithelial ovarian neop lasms:An immunohistochemical study.Bio Med Res Int，2014，2014: 178410.8 Rhodus NL，Cheng B，BowlesW，et a1.Proinflammatory cytokine levels in saliva before and after treatment of(erosive)oral lichen planus with dexamethasone.Oral Dis，2006，12(2):112－116.

9 Susin SA，Lorenzo HK，Zamzami N，et al.Molecular characterization ofmitochondrial apoptosis－inducing factor.Nature，1999，397:441－446.

10 Joza N，Susin SA，Daugas E，et a1.Essential role of themitechondrial apoptoois－inducing factor in programmed cell death. Nature，2001，410:549－554.

11 Fan TL，Tain F，YiS，etal.Implications of bit1 and AIF overexpressions in esophageal squamous cell carcinoma.Tomour Biol，2014，35(1):519－527.

12 Jeong EG，Lee JW，Soung YH，et al.Immunohistochem ical and mutational analysis of apoptosis－inducing factor(AIF)in colorectal carcinomas.APMIS，2006，114(12):867－873.

(收稿:2014－09－02 修回:2014－11－19)

Expression of apoptosis related protein in patientswith lichen planus

GE Jing，WANG Jun，ZHAO Han，et al.Department ofDermotology，the Affiliated Hospital ofQingdao University，Qingdao，266000

Objective:To detect the expression of nuclear factor kappa B(NF－κB)and apoptosis－inducing factor(AIF)in the patients with lichen planus(LP).M ethods:The integrated optical density and apoptosis index of NF－κB and AIF in paraffin－embedded samples of lichen planus(n＝25)and normal skin(n＝25)were detected with immunohistochemistry and term inal deoxynucleotidyl transferase－mediated dUTP nike end labeling(TUNEL).Results:The integrated optical densities of NF－κB and AIF in the LP lesions were higher than those in the control group(P＜0.01).Keratinocyte apoptosis index in the LP lesionswas significantly higher than that in the control group(P＜0.01).Therewas no correlation between the expression intensity of NF－κB and apoptosis index(P＞0.05).The expression intensity of AIFwas correlated with apoptosis index(P＜0.01).Conclusion:The expression of AIF in the lesions of lichen planusmay be involved in the cell apoptosis of keratinocytes.

lichen planus；NF－κB；AIF；immunohistochemistry；apoptosis

1青岛大学，青岛，266000 2青岛大学附属医院，青岛，266000∗通信作者