薏米糠蛋白的提取工艺优化及其功能性质

林 莉，秦礼康,*，张 伟

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州鑫龙食品开发有限公司，贵州 安顺 561000）

薏米糠蛋白的提取工艺优化及其功能性质

林 莉1，秦礼康1,*，张 伟2

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州鑫龙食品开发有限公司，贵州 安顺 561000）

以超临界脱脂薏米糠粉粕为研究对象，采用正交试验优化碱提蛋白工艺，并以酶法提取水相液蛋白为对照，比较两种蛋白的功能性质。结果表明，最佳的碱提条件为料液比1∶8、提取温度45 ℃、提取时间4 h、pH 9，平均提取率为63.75%；两种蛋白均含16 种氨基酸，且7 种必需氨基酸齐全；水酶法提取蛋白的溶解性、乳化性及其稳定性、起泡性均优于粉粕碱提蛋白。

薏米糠蛋白；提取；功能性质

薏苡（Coix lachrymajobi L.）为禾本科（Gramineae），属草本植物，它的干燥成熟种仁称为薏苡仁，俗称“苡仁米”、“药王米”、“回回米”、“六谷米”等，其蛋白质、脂肪、矿物质等成分含量远超过大米，含有薏苡酯等功效成分，有丰富的营养药用价值[1]。薏米糠是薏苡在加工成精米的过程中所产生的黄粉，其占总质量的5%左右，与米糠营养成分相似[2]。目前主要用作饲料，在畜牧业发展中有重要作用。

碱法提取简单易行，提取率及纯度较高，但产品风味和色泽不理想[3]。酶法提取反应条件较为温和，对蛋白影响小，而且降解后的多肽具有一定的生理活性，在增大米糠蛋白溶解度同时，能改善蛋白发泡、乳化等物化性能[4]，但提取率低，成本较高。

本实验以薏米糠蛋白的提取方法为参照，优化了碱提薏米糠蛋白工艺，比较了碱提薏米糠蛋白和水酶法提取蛋白的纯度及功能性质，旨在为薏米糠的进一步利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

薏米糠（薏米经筛选除杂、干燥脱壳后，碾成精白米过程中产生的黄粉） 贵州安顺鑫龙食品开发有限公司；脱脂薏米糠（超临界CO2提油所得薏米糠粉粕[5]）实验室自制。

氢氧化钠、盐酸、硼酸、硫酸铜、硫酸钾等（均为分析纯） 成都金山化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-S6型电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；UV-7520 PC型紫外-可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司；AR224CN型电子天平 奥豪斯仪器（上海）有限公司；电热恒温鼓风干燥箱 上海锦昱科学仪器有限公司；BZF-30型L-8800氨基酸分析仪 日本Hitachi Science Systems公司；TGL20M型台式高速冷冻离心机 长沙迈佳森仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 碱提薏米糠粉粕蛋白工艺流程

称取50 g脱脂薏米糠粉粕，过60 目筛后按照一定的料液比（g/mL）与水混合，加入0.1 mol/L NaOH溶液调节pH值，在一定的温度条件下反应一段时间，4 000 r/min离心15 min，取上清液。用0.1 mol/L HCl溶液调节上清液pH值至等电点（5.5），将溶液倒入培养皿并放置于真空干燥箱中冷冻干燥24 h，得薏米糠蛋白粉[6-7]。

1.3.2 碱提薏米糠粉粕蛋白的正交试验设计

1.3.2.1 单因素试验

准确称取一定量过60 目筛的脱脂薏米糠，分别以料液比、提取时间、提取温度、pH值4 个因素进行单因素试验，以蛋白提取率为衡量指标。具体方案见表1。

表 1 粉粕碱提蛋白条件的单因素试验条件Table 1 Single factor design for alkali extraction of protein

1.3.2.2 正交试验优化碱提薏米糠粉粕蛋白工艺参数

在单因素试验基础上，选用L9（34）正交试验设计选出碱提薏米糠蛋白提取率的最佳条件。

表 2 正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.3 水酶法提取水相液蛋白工艺流程

分别称取未脱脂薏米糠粉50 g，过60 目筛后按照1∶6（g/mL）的料液比与水混合，在沸水中煮1 h，冷却后调节pH 6，然后加入质量分数0.8%的酶（淀粉酶+中性蛋白酶）在50 ℃条件下进行酶解反应3 h，待酶解结束，冷却加入150 mL正己烷萃取10 min，同时用玻璃棒搅拌，4 000 r/min转速离心得到油和有机溶剂、乳状液、水解液、渣。收集水解液浓缩，放入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥24 h，得到水酶法提取蛋白粉[8-9]。

1.3.4 分析测定方法

1.3.4.1 蛋白含量测定

采用凯氏定氮法测定蛋白含量，由式（1）、（2）计算蛋白提取率和纯度。

1.3.4.2 薏米糠蛋白氨基酸评分

采用氨基酸自动分析仪法，氨基酸评分（amino acid scores，AAS）计算[10]如式（3）所示。

1.3.4.3 薏米糠蛋白基本性质

1）溶解性

称取约1 g左右的薏米糠蛋白，加入50 mL蒸馏水，室温条件下磁力搅拌45 min，3 000 r/min离心30 min，取上清液用凯氏定氮法测定蛋白含量，重复3 次[11]。

2）乳化性及其稳定性

配制1%蛋白溶液，在室温条件下搅拌使其充分溶解；将5 mL配制好的蛋白溶液和5 mL大豆色拉油混合均匀在10 000 r/min转速均质30 s，形成均一的乳化溶液后在2 500 r/min条件下离心5 min。测量离心管中乳化层高度和液体总高度，重复测定3 次[12]。用式（5）计算。

将上述处理好的乳化样品置于80 ℃水浴中保温30 min，然后于2 500 r/min转速离心10 min，计算其乳化稳定性。

3）持水性

精确称取1g的薏米糠蛋白置于已称质量的离心管中，缓慢加入10mL水并用玻璃棒搅拌至样品呈浆状析出，振荡离心管并在2 500r/min转速离心10min，测定上清液体积[13]。

4）吸油性

准确称取0.5 g薏米糠蛋白于10 mL离心管中，加入5 mL大豆油搅拌1 min，放置于室温条件下保温30 min并在2 500 r/min转速离心20 min，体积前后差即为吸油量[13]。

式中：V为前后体积差/mL；m为蛋白质量/g。

5）起泡性及其稳定性

配制5%薏米糠蛋白溶液100 mL放入烧杯中，以10 000 r/min速率均质3 min，记录液面高度为h0，静置30 min后再次记录液面高度为h30[14]。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0软件及采用Origin软件对实验数据进行处理及作图。

2 结果与分析

2.1 粉粕碱提蛋白单因素试验结果

2.1.1 料液比对粉粕碱提蛋白提取率影响

图 1 料液比对蛋白提取率影响Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction rate of protein

从图1可看出，在1∶5～1∶8范围内，随着溶剂用量增加，蛋白提取率逐渐增加，当料液比为1∶8时提取率达到53.99%。当料液比为1∶9时，蛋白提取率开始呈下降趋势。因此，粉粕碱提蛋白提取率的最佳料液比为1∶8。

2.1.2 提取时间对粉粕碱提蛋白提取率影响

图 2 提取时间对蛋白提取率影响Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate of protein

从图2可知，提取时间为3 h，蛋白提取率达到最大值55.14%。但是当提取时间在3 h之后，蛋白提取率逐渐呈下降趋势。其原因可能是随着提取时间的逐渐延长，薏米糠蛋白不断被溶解出来，达到一定时间其溶解量达到峰值，延长提取时间，溶出的蛋白会发生水解导致提取率降低[15]。因此，粉粕碱提蛋白提取率的最佳时间为3 h。

2.1.3 提取温度对粉粕碱提蛋白提取率影响

图 3 提取温度对蛋白提取率影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of protein

从图3可知，粉粕碱提蛋白提取率在40 ℃之前随着温度的升高不断增加，在40 ℃时达到最大值，当温度不断增加，蛋白提取率又呈下降趋势。其原因可能是由于高温使淀粉发生糊化，形成了黏稠体系妨碍蛋白的溶出[16]。因此，粉粕碱提蛋白的最佳温度为40 ℃。

2.1.4 pH值对粉粕碱提蛋白提取率影响

图 4 pH值对蛋白提取率影响Fig.4 Effect of solvent pH on the extraction rate of protein

由图4可知，蛋白提取率随着pH值增加而增加，当pH值增加到9后，蛋白提取率呈平缓趋势。由于薏米糠粉粕中存在蛋白质、纤维素等物质结合形成的粒子，并且存在大量的二硫键和疏水基团，这些紧密结构都会导致蛋白不易溶出[17]。在碱性环境中这些结构会变疏松，并且氢键会被破坏，某些极性基团发生解离，从而提高蛋白溶出量。但是，强碱性也会引起薏米糠蛋白理化性质的改变，氨基酸间会发生脱水缩合反应而产生有毒物质[18]，降低其营养价值。因此，综合考虑粉粕碱提蛋白最佳pH值为9。

2.2 粉粕碱提蛋白正交试验结果

在单因素试验基础上，以蛋白提取率作为评价指标，利用正交试验筛选出粉粕碱提蛋白的最佳工艺参数，试验结果见表3。

表 3 粉粕碱提蛋白正交试验设计及结果Table 3 Results of orthogonal array experiments for the optimization of alkali extraction of protein

由极差分析可得出影响蛋白提取率的主次因素为pH值＞提取温度＞提取时间＞料液比，最佳提取条件是A2B3C3D2，即提取pH 9、提取温度45 ℃、提取时间4h、料液比1∶8。在正交试验得出的最佳条件下进行碱提粉粕蛋白，其提取率为63.75%，此结果与曲晓婷等[19]的相似。

2.3 两种提取方式对薏米糠蛋白提取率及纯度影响

图 5 不同提取方式对蛋白提取率影响Fig.5 Effect of extraction methods on the extraction rate of protein

从图5可看出，粉粕碱提蛋白得率比水酶法提取蛋白高，粉粕碱提蛋白得率为63.75%，水酶法提取蛋白得率为42.67%。其原因在于碱液可以使薏米糠中紧密的结构变得疏松，同时碱液可使某些基团发生解离，促使蛋白质分离出来[20]。

图 6 不同提取方式对蛋白纯度的影响Fig.6 Effect of extraction methods on protein purity

从图6可看出，两种方法所得到的薏米糠蛋白纯度均不高，但粉粕碱提蛋白纯度高于水酶法提取蛋白，粉粕碱提蛋白纯度71.55%、水酶法提取蛋白纯度55.93%。其原因可能是薏米糠中纤维和淀粉含量较高，而水酶法加入淀粉酶后淀粉等水解成单糖溶解在水解液中，导致水解液中的蛋白纯度不高。

2.4 两种薏米糠蛋白氨基酸分析

表 4 薏米糠蛋白氨基酸组成分析Table 4 Amino acid composition of adlay bran protein

从表4可看出，两种蛋白氨基酸在组成上完全相同均有16 种，但含量有差别，粉粕碱提蛋白的总氨基酸远远高于水酶法水解。两种方式所得到的蛋白均含有7 种必需氨基酸，从每种氨基酸含量来看，碱提方式也比水酶法得到的氨基酸含量高。两种方式所得蛋白中含量最高的氨基酸为谷氨酸，粉粕碱提蛋白达到139.82 mg/g，水酶法提取蛋白为37.06 mg/g，谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应，是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一[21]。在必需氨基酸中，亮氨酸含量较其他更高，分别为82.46 mg/g和13.33 mg/g，亮氨酸的缺乏会导致低血糖症状[22]。赖氨酸具有促进胃酸分泌、增进食欲的作用，在所得蛋白中赖氨酸的含量分别为45.87 mg/g和13.18 mg/g。从表5可看出，粉粕碱提蛋白氨基酸评分与FAO/WHO推荐模式接近，必需氨基酸构成合理，限制性氨基酸为蛋氨酸、胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸；水酶法提取蛋白氨基酸评分均小于1，必需氨基酸均为限制性氨基酸。粉粕碱提蛋白和水酶法提取蛋白的氨基酸综合评分分别为1.05和0.23，因此，粉粕碱提蛋白的营养价值高于水酶法提取蛋白。

Tab

表 5 薏米糠蛋白必需氨基酸组成评价Table 5 Amino acid scores (AAS) in adlay bran protein

2.5 薏米糠蛋白基本性质测定

2.5.1 薏米糠蛋白溶解性

图 7 不同薏米糠蛋白溶解性折线图Fig.7 Solubility of adlay bran proteins extracted by different methods

蛋白溶解性的优劣直接关系到蛋白质生理功能的强弱，而在不同pH值条件下其溶解性也不同。从图7可看出，粉粕碱提蛋白的溶解性随pH值的变化呈先降低再升高的趋势，在pH 5时溶解性最低，这是由于碱提蛋白的等电点在pH 5附近，蛋白在此pH值时易析出，故溶解性差。而水酶法提取蛋白溶解性的变化趋势与碱提不同，在pH 5时仍然有较好的溶解性，这是因为酶法提取时加入的酶将薏米糠蛋白酶解成小肽，从而提高了溶解性。

2.5.2 薏米糠蛋白乳化性及其稳定性

图 8 不同薏米糠蛋白乳化性折线图Fig.8 Emulsifying properties of adlay bran proteins extracted by different methods

从图8、9可看出，两种薏米糠蛋白乳化性及乳化稳定性与蛋白溶解性呈正相关性，在pH 5附近时，蛋白溶解性最小，其乳化性及其稳定性也最小。这主要是由于当蛋白溶解性小时，蛋白无法与油脂形成乳化液。因此，要提高薏米糠蛋白的乳化性及其稳定性，就要增加其溶解性。

图 9 不同薏米糠蛋白乳化稳定性折线图Fig.9 Emulsifying stability of adlay bran proteins extracted by different methods

2.5.3 薏米糠蛋白持水性及吸油性

表 6 不同薏米糠蛋白的持水/持油能力Table 6 Water-holding and oil-holding capacities of adlay bran proteins extracted by different methods

文献[24]报道，蛋白质的持水能力与溶解性有关，溶解性越好，其持水能力越差。粉粕碱提蛋白的溶解性没有水酶法提取蛋白高，故其持水能力好。蛋白质的持油性是与其分子表面的亲脂基团性质有关[25]，容积密度越大，持油能力越大，粉粕碱提蛋白的持油能力为3.85mL/g。

2.5.4 起泡性及泡沫稳定性

图 10 不同薏米糠蛋白起泡性折线图Fig.10 Foaming capacity of adlay bran proteins extracted by different methods

图 11 不同薏米糠蛋白起泡稳定性折线图Fig.11 Foaming stability of adlay bran proteins extracted by different methods

蛋白的起泡性是指能降低气-液界面表面张力而帮助形成起泡的能力[26]。起泡稳定性是指蛋白维持泡沫稳定存在的能力。从图10、11可看出，两种薏米糠蛋白起泡性是随pH值的增大呈上升趋势，但是在等电点（pH 5）附近起泡能力弱，而起泡稳定性正好相反。蛋白的起泡性与溶解性存在一定的关系，蛋白溶解越多，可溶部分就能参与泡沫形成，在等电点附近蛋白溶解性很低，故起泡性差；对于泡沫稳定性而言，等电点附近的泡沫最稳定，因为未溶解的蛋白通过吸附，增加了蛋白膜的黏合力[27]。

3 结 论

1）在单因素试验的基础上，采用正交试验对粉粕碱提蛋白工艺进行优化，得到最佳的碱提蛋白条件为料液比1∶8、提取温度45 ℃、提取时间4 h、pH 9。在此条件基础上进行验证实验，蛋白提取率为63.75%。2）比较两种蛋白的提取率和纯度，粉粕碱提蛋白的得率（63.75%）高于水酶法提取蛋白（42.67%），粉粕碱提蛋白纯度为71.55%，水酶法提取蛋白纯度为55.93%；3）两种蛋白含有16 种氨基酸且7 种必需氨基酸齐全，但粉粕碱提蛋白的氨基酸含量比水酶法提取蛋白高。4）水酶法提取蛋白的溶解性、乳化性及其稳定性、起泡性均优于粉粕碱提蛋白。

[1] 张明发, 沈雅琴. 薏苡仁药理研究进展[J]. 上海医药, 2007, 28(8): 360-363.

[2] 华正根, 王金亮, 陈先娟, 等. 薏苡仁糠的综合利用[J]. 农业机械, 2013(10): 43-46.

[3] HAMADA J S. Use of protease to enhance solubilization of rice bran protein[J]. Journal of Food Biochemistry, 1999, 23(3): 307-321.

[4] 王立, 周素梅, 陈正行. 提取米糠蛋白的探讨[J]. 西部粮油科技, 2002(3): 15-17.

[5] 李大鹏, 吴伯千. 超临界CO2萃取薏苡仁油工艺条件优化[J]. 中国现代应用药学杂志, 2005, 22(1): 17-20.

[6] 李新华, 富艳鑫, 郑煜焱. 米糠蛋白提取工艺条件的优化[J]. 食品科学, 2010, 31(22): 251-254.

[7] 郑耀华, 徐亚元, 张齐, 等. 鲜米糠中蛋白质的提取工艺研究[J]. 农产品加工: 学刊, 2012(3): 73-79.

[8] 陈季旺, 姚惠源, 张小勇, 等. 米糠可溶性蛋白的提取工艺和特性研究[J]. 中国油脂, 2003, 28(2): 46-50.

[9] 华娣, 许时婴. 酶法提取花生油与花生水解蛋白的研究[J]. 食品与机械, 2006, 22(6): 16-19.

[10] 吴世兰, 秦礼康, 蒋成刚, 等. 核桃仁碱液去皮过程中营养功能成分动态变化[J]. 中国油脂, 2013, 38(2): 84-87.

[11] 郑煜焱, 曾洁, 李晶, 等. 米糠蛋白的组成及功能性[J]. 食品科学, 2012, 33(23): 143-149.

[12] 曲晓婷, 张名位, 温其标, 等. 米糠蛋白提取工艺的优化及其特性研究[J]. 中国农业科学, 2008, 41(2): 525-532.

[13] BEUCHATIR. Functional and electrophoretic characteristies of succinylated peanut fl our proteins[J]. Journal Agrieultural and Food Chemistry, 1977, 25(2): 258-263.

[14] WANISKA R D, KINSELLA J E. Foaming properties of proteins: evaluation of a column aeration apparatus using albumin[J]. Joumal of Food Science, 1979, 44(1): 1398-1403.

[15] 陈义勇. 米糠可溶性蛋白提取工艺中各因素影响的研究[J]. 现代食品科技, 2006, 22(4): 64-70.

[16] PARAMAN I, HETTIARACHCHY N S, SCHAEFER C. Hydrophobicity solubility and emulsifying properties of enzyme modified rice endosperm protein[J]. Cereal Chemistry, 2007, 84(4): 343-349.

[17] HAMADA J S. Characterization of protein fractions of rice bran to devise effective methods of protein solubilization[J]. Cereal Chemistry, 1991, 74(5): 662-668.

[18] 李静, 汪志华. 米糠蛋白的特性及提取工艺[J]. 湖北农业科学, 2006, 45(6): 810-812.

[19] 曲晓婷, 张名位, 温其标, 等. 二次通用旋转组合设计法优化米糠蛋白提取工艺[J]. 食品研究与开发, 2007, 28(1): 102-106.

[20] WANG M, HETTIARACHY N S, QI M, et al. Preparation and functional properties of rice bran protein isolate[J]. Journal Agriculture Food Chemistry, 1999, 47(2): 411-416.

[21] 陈中爱, 曾海英, 董宏伟. 酶法提取糖渣蛋白的工艺研究[J]. 食品科技, 2013, 38(6): 236-241.

[22] PATRICK A L, DARIO R A. Deciphering the function of leucine-rich repeat kinase 2 and targeting its dysfunction in disease[J]. Biochemical Society Transations, 40(5): 1039-1041.

[23] 贾俊强, 马海乐, 骆琳, 等. 脱脂小麦胚芽蛋白分类及其氨基酸组成分析[J]. 中国粮油学报, 2009, 24(2): 41-45.

[24] 管斌, 林洪, 王广策. 食品蛋白质化学[M]. 北京: 化学工业出版社, 2005: 12-53.

[25] DEDEH S S, STANLEY D. Cowpea protein: use of response surface methodology in prediction cowpea protein extractability[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1979, 27(6): 1238-1241.

[26] 陶健, 毛立新, 杨小姣, 等. 荞麦蛋白的功能特性研究[J]. 中国粮油学报, 2005, 20(5): 46-50.

[27] 周瑞宝. 植物蛋白功能原理与工艺[M]. 北京: 化学工业出版社, 2008: 42-68.

Extraction and Functional Properties of Adlay Bran Protein

LIN Li1, QIN Likang1,*, ZHANG Wei2
(1. School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. Food Development Co. Ltd. of Xinlong, Anshun 561000, China)

The alkali extraction of protein from defatted adlay bran was optimized using orthogonal array design and the functional properties of the extracted protein were investigated in comparison to that obtained by aqueous enzymatic extraction. The optimal extraction conditions were found to be extraction at 45 ℃ for 4 h with a solid-to-solvent ratio of 1:8 at pH 9, resulting in an average extraction yield of 63.75%. The products obtained by both extraction methods contained 16 amino acids including 7 essential ones. However, the protein obtained by aqueous enzymatic extraction was superior to that obtained by this method regarding solubility, emulsifying properties and foaming properties.

adlay bran protein; extraction; functional properties

TS213

A

1002-6630（2015）02-0046-06

10.7506/spkx1002-6630-201502009

2014-06-22

贵州省重大专项（黔科合重大专项字[2013]6010-5；黔科合重大专项字[2014]6023）；贵州省农业攻关项目（黔科合农G字[2012]4001）；省市县三方合作项目（安西科合gzassxxlch[2012]3006（1）；安市科合（2012）5）

林莉（1989—），女，硕士研究生，研究方向为食品营养与安全。E-mail：240324317@qq.com

*通信作者：秦礼康（1965—），男，教授，博士，研究方向为食品加工与安全。E-mail：likangqin@126.com