脓毒症脏器功能不全与细胞自噬关系的研究现状

万晟霞(综述)，石 斌(审校)

(1.兰州大学第一临床医学院重症医学科，兰州730000； 2.上海交通大学附属松江区中心医院急诊危重病科，上海201600)



脓毒症脏器功能不全与细胞自噬关系的研究现状

万晟霞1(综述)，石 斌2※(审校)

(1.兰州大学第一临床医学院重症医学科，兰州730000； 2.上海交通大学附属松江区中心医院急诊危重病科，上海201600)

自噬是一种广泛存在于真核细胞内的溶酶体依赖性降解途径，被称为Ⅱ型凋亡，其在自噬相关基因的严格调控下在细胞发育、细胞免疫以及多种疾病中发挥重要作用。近来有研究发现，自噬参与脓毒症疾病发展过程，与多脏器功能不全关系密切。自噬途径异常可能是脓毒症脏器功能损伤的重要原因，该文对自噬及其在脓毒症中的表现、分子机制以及调节途径进行综述，旨在了解脓毒症脏器损伤的机制，以期为脓毒症脏器功能保护寻求新的途径。

自噬；脓毒症；多脏器功能不全

自噬广泛存在于真核细胞中，是一种溶酶体依赖性降解途径，可以调节细胞内长寿命蛋白和细胞器的降解，降解产物可作为合成新细胞器的原料，维持机体稳态[1]。自噬在生物体正常发育及对不利因素的反应中极其关键，对防止某些疾病(如心肌病、肿瘤、神经退行性病变等)以及对延缓衰老、延长寿命和抵御病原微生物侵袭有积极作用[2]。随着对自噬研究的不断深入，自噬在炎症、感染以及缺血缺氧等病理过程中的作用逐渐浮出水面。近年来，有研究表明，自噬在脓毒症细胞程序性死亡中发挥重要作用[3-4]。但目前尚无统一的结论表明自噬在脓毒症中的保护作用，且机制尚不明确。现就自噬在脓毒症领域的研究进展予以综述。

1 自噬的分类及功能

1.1 自噬种类 细胞内自噬主要包括3种方式：巨自噬、微自噬、分子伴侣介导的自噬[5]。微自噬即溶酶体膜直接内陷将底物包裹并降解的过程；分子伴侣介导的自噬即部分分子伴侣引导待降解蛋白转入溶酶体降解的过程；巨自噬占细胞内自噬的95%，是细胞内降解和处理细胞器及蛋白质的主要途径；其机制涉及双层膜自噬泡的形成，并靶向吞噬细胞质原料(如受损的细胞器和变性的蛋白质)，然后与溶酶体融合形成单层膜的自噬溶酶体，在溶酶体酶的作用下促进降解过程，形成代谢前体分子物质的再生(如氨基酸和脂肪酸)，用于合成代谢和产能[6]。当发生感染时，自噬通过吞噬并降解入侵病原微生物的方式与机体免疫反应协同作用，发挥保护作用。此外，自噬在清除病原体的过程中通过调节抗原先露而对免疫系统产生影响，表现为促进淋巴细胞成熟和促炎因子的产生[7]。目前具体机制仍不明确。

1.2 自噬机制 目前发现至少有30种自噬相关(autophagy associated gene，Atg)基因，最初是在酵母中发现，哺乳动物体内也存在Atg基因同系物，并且在各种应激刺激下，多细胞生物体内可观察到与单细胞生物相同的自噬过程[8]。自噬是一种受Atg基因严格调控的细胞内降解方式[9]。研究发现，自噬存在特殊的分子机制，调节细菌、变性蛋白及细胞器降解过程，清除受损细胞器，对保持哺乳动物正常细胞器数量恒定发挥了重要作用[10]。自噬途径的激活需要大分子信号复合物的参与，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是自噬途径中重要的信号物质之一，在一些辅助蛋白参与下形成mTORC1(mTOR complex 1)，调节大分子底物复合物启动自噬途径，例如哺乳动物ULK1激酶(mammalian uncoordinated-51-like protein kinase，酵母Atg1同源蛋白)[11]。饥饿时，通过抑制mTOR激酶活性，从而使ULK1激酶激活而启动自噬[12]。自噬分子机制目前仍在研究中，研究认为自噬体膜来源于内质网，在大分子调节复合物Beclin 1和Vps34(一种三型磷脂酰肌醇3-激酶，Class Ⅲ phosphatidylinositol-3-kinase，PIK3C3)的作用下，形成自噬体[13]。随后自噬体的延伸需要2个泛素样共轭体(包括Atg12在Atg7的作用下与Atg5形成的Atg5-Atg12复合体，被称为E1样共轭体，Atg10被称为E2样共轭体)的参与，其中Atg5-Atg12复合体与Atg16L(酵母Atg16的哺乳动物同系物)结合，使自噬体膜伸长[14]。另一个共轭系统为泛素样蛋白微管相关轻链蛋白3(microtubule-associated protein-1 light chain 3，LC3)在磷脂酰乙醇胺脂质体作用下从LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ，定位于自噬体膜上，被视为哺乳动物体内重要的调节阶段和自噬体形成的标志[15-16]。最终，自噬体成熟并与溶酶体融合，在溶酶体水解酶作用下降解自噬体内的物质，形成生物能量的再循环；这一过程中也需要一些调节蛋白(如小三磷酸鸟苷酶和溶酶体相关膜蛋白2)的参与[14]。

1.3 自噬的调节途径 在生物体内，自噬主要受氨基酸、胰岛素以及能量变化的调节，当细胞能量降低、氨基酸缺乏以及胰岛素升高情况下，自噬核心蛋白mTOR抑制，自噬激活，吞噬长链蛋白形成自噬溶酶体，以胞吐方式将降解产物释放至细胞质，用于生物再合成，形成细胞内生物能量循环，促进细胞生长发育[12]。研究发现，自噬在病理环境下也会被激活，例如在氧化应激、缺血-再灌注、肿瘤坏死因子α毒性化合物等因素刺激下，线粒体渗透性通道开放，线粒体肿胀，释放细胞色素C等凋亡因子，在此情况下，细胞可启动自噬来清除受损的线粒体，避免凋亡因子释放进入胞质[2]。自噬具有双重作用，当自噬适度激活时，可加速胞内蛋白降解，产生氨基酸等小分子，防止错误蛋白堆积，抵抗能量不足，进而促进细胞存活[17]；当自噬过度激活时，可导致细胞裂解，引起自噬性细胞死亡，即Ⅱ型细胞程序性死亡[18]。

2 自噬与脓毒症

2.1 自噬障碍导致脓毒症多脏器损伤 脓毒症是多种疾病在发生发展过程中所表现出来的一种共同的病理生理过程，最终可致多器官功能障碍，占重症监护病房患者死亡原因的首位[19]。脓毒症相关的器官功能不全一直困扰着临床医师，了解其致病机制以寻求合理有效的治疗手段对于提高脓毒性休克患者的存活率及预后有重要的意义。随着对自噬研究的深入，自噬与脓毒症的关系越来越受到人们的重视，但是关于自噬在脓毒症中的作用尚知之甚少。Watanabe等[3]通过对6例脓毒症死亡患者进行尸检发现，在患者肝脏细胞中可观察到大量自噬空泡聚集，随后在盲肠结扎穿刺(cecal ligation and puncture,CLP)大鼠肝脏中也发现自噬泡的异常聚集；同时发现线粒体超微结构损害较其他细胞器明显，于是提出脓毒症脏器损伤与自噬异常现象有关，自噬异常可能与线粒体功能失调相关。研究Atg7基因剔除小鼠模型发现，肿瘤坏死因子α刺激后肝细胞死亡增多，腺苷三磷酸减少，白蛋白产生减少，表现出脓毒症导致肝衰竭[20]。剔除Atg16L1的动物模型显示脓毒症诱导的炎症反应增强，产生大量促炎因子白细胞介素(interleukin，IL)1β和IL-18[21]；剔除Atg基因Beclin 1和LC3-Ⅱ的小鼠体内表达大量的IL-18，更易向脓毒性休克进展[22]。以上研究表明，Atg基因缺失导致自噬障碍，可促进炎症反应，最终导致异常线粒体蓄积，产生大量活性氧类物质，促进细胞凋亡与坏死；提示自噬障碍可能导致脓毒症状态下细胞功能改变。

一项对急性胰腺炎动物腺泡细胞自噬的研究显示，自噬相关蛋白表达缺乏与自噬泡的聚集和自噬溶酶体数量减少相关；促进促炎因子释放，胰腺腺泡细胞坏死明显；通过建立内毒素血症小鼠模型检测胰腺腺泡细胞发现，在形态学、免疫组织化学、生物化学水平，溶酶体相关膜蛋白2表达缺失，胰腺腺泡内自噬空泡的聚集；研究者认为，急性胰腺炎腺泡细胞自噬空泡聚集是由于自噬最终阶段受到内毒素血症抑制所致，导致自噬体与溶酶体融合障碍[23]，这是首个提出自噬障碍的报道。随后，对脓毒症大鼠左心室内进行24 h形态学观察发现，自噬泡数量增加而自噬溶酶体数量较少，即自噬泡形成增多然而其降解减少，提示在脓毒症心肌组织中也存在自噬途径不完整的现象；给予自噬诱导剂雷帕霉素后，完整的自噬增加，CLP诱导的心肌损伤减轻，证明完整的自噬对器官功能保护是有益的[24]。对脓毒症时大鼠肾小管上皮组织自噬行为的体内研究显示，LC3-Ⅱ呈现早期短暂的升高，随时间推移逐渐下降，自噬体主要聚集在血管紧张素转换酶较多的近端肾小管区，增强自噬后发现，脓毒症诱导近端肾小管损伤减轻，提示保证充分的自噬可防止细胞死亡[25]。新近的研究报道，在CLP诱导的动物模型中同样观察到自噬体-溶酶体融合从CLP后8～24 h呈现逐渐减少的趋势[23，26]，形态学及分子生物学水平证实了脓毒症过程中存在自噬障碍。上述研究均显示，自噬在脓毒症早期被激活，随着病程进展受体内因素影响自噬过程障碍，特别是自噬溶酶体形成障碍使得自噬在脓毒症过程中没有发挥出有效的清除保护作用。也有研究认为，脓毒症过程中自噬是受到抑制的，在CLP动物模型的肺组织内，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Atg5和Rab7均较对照组下降；给予激活蛋白C可以明显促进自噬，使脓毒症小鼠的肺组织损伤减轻，7 d存活率增加[27]，提示促进自噬可明显改善脓毒症相关的损伤。

目前关于脓毒症肠道组织中自噬行为的在体实验较少，研究发现，小肠上皮细胞自噬现象明显，损伤的自噬可致小肠炎症进展[28]。肿瘤坏死因子α诱导的体外实验显示，受损的自噬不能保持肠上皮细胞的内环境稳定，表现为上皮细胞黏附能力下降，失去了与基底膜之间的黏附力[29]，表明损伤的自噬可致肠黏膜屏障受损。以上研究提示，自噬在脓毒症脏器损害过程中并未发挥明显的保护作用。最近的一项研究对这一观点提出了异议，Takahashi等[30]对脓毒症时肝脏细胞的自噬行为进行了深入研究，首次在CLP模型的动物体内检测肝脏组织中的自噬活性；实验发现，自噬活性在CLP 24 h并没有降低；由此认为在这个动物模型中自噬途径是完整进行的；通过给予自噬抑制剂氯喹进行对照研究发现，抑制剂组动物的肝酶指标以及病死率较CLP组明显增加，故这项研究提出，在CLP诱导的肝脏损伤中，自噬在脓毒症过程中对器官功能发挥着重要的保护作用。目前关于脓毒症过程中自噬行为的报道很有限，对于其在脓毒症过程中的作用尚有争论。

2.2 自噬调节机制 尽管如此，众多研究均认为，促进自噬对CLP诱导的器官损害是有益的。除了激活蛋白C可在CLP动物肺组织中表现出与雷帕霉素相当的促进自噬的作用外[27]，研究发现，脑肠肽Ghrelin在脓毒症时不仅可调节细胞能量，减轻炎症反应，改善组织灌注[31]，其对自噬也表现出了调节潜能。经胃管给幼猪灌注Ghrelin观察其肠上皮发现，Ghrelin可通过肠黏膜细胞自噬促进上皮细胞的生长[32]。在钴诱导的缺血心肌中，Ghrelin通过腺苷酸活化蛋白激酶途径激活自噬，减轻缺血缺氧损伤，保护心肌细胞[33]。脓毒症时，Ghrelin是否同样可以改善自噬，为脏器功能保护提供益处，这是值得探索的。在未来的医学领域里，通过药物促进自噬可能成为治疗脓毒症相关脏器损伤的新途径。关于体内自噬的调节机制，还没有文献明确阐释。目前，在上述的研究中认为，脓毒症时抑制自噬的主要因素包括核因子κB的过度激活、早期高胰岛素血症、能量器官功能失调等。细胞实验显示，给予尤文细胞肿瘤坏死因子α刺激后，核因子κB过度激活，通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B途径抑制三磷酸鸟苷酶活化蛋白复合物TSC1/TSC2,进而抑制下游RheB(ras homolog enriched in brain)，激活自噬核心蛋白mTOR，发挥抑制自噬的作用[16]。此外，已经发现在大鼠脓毒症模型中早期(CLP 5 h)存在高胰岛素血症[34]。胰岛素是已知的强有力的自噬抑制剂之一，主要通过与细胞表面的胰岛素受体结合，经Ⅰ型磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)途径抑制三磷酸鸟苷酶活化蛋白复合物TSC1/TSC2异源二聚体，激活mTOR，使自噬受抑[25]。此外，能量失衡也会影响自噬的过程，低能量或低腺苷三磷酸影响肝激酶B1/腺苷酸活化蛋白激酶途径，激活mTor，抑制自噬[12]。虽然以上的自噬途径在酵母模型中已经研究明确，但是在哺乳动物脓毒症时，是何种因素影响自噬，或者存在多影响因素，以及在不同脏器自噬行为改变是否一致，这些问题仍有待更深层次的研究。了解自噬调节机制对于进行药物干预治疗具有十分重要的意义。

3 小 结

自噬是细胞内能量平衡与蛋白质再循环的重要途径，自噬在生理及病理环境下均发挥着重要作用。目前对于自噬与脓毒症脏器损害的关系仍在研究中，随着检验手段和实验技术的不断发展，对于体内脏器自噬活性的研究会越来越多，自噬在脓毒症中的作用将越来越明了。脓毒症过程中脏器自噬水平的研究不仅可以为疾病的发生、发展提供新的认识，而且有可能成为治疗脓毒症相关脏器损伤的新方向。

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Research Status of the Relationship between Sepsis Induced Organs Dysfunction and Cells Autophagy

WANSheng-xia1,SHIBin2.

(1.DepartmentofIntensiveCareUnit,theFirstClinicalHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000，China; 2.DepartmentofIntensiveCareUnit,SongjiangCentralHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai201600，China)

Autophagy is a lysosome-dependent degradation pathway that widely exists in eukaryotic cells,known as type Ⅱ apoptosis.It plays an important role in cell development,immunity,and various diseases under strict control of autophagy associated genes.Recently,several studies have found that autophagy is involved in the development of sepsis,and closely related with multiple organ dysfunction.Autophagy pathway abnormalities may be an important reason for organ dysfunction in sepsis.Here is to make a review of the manifestation,molecular mechanism and regulatory pathway of autophagy in sepsis,in order to understand the mechanisms of organ injury in sepsis and seek new way to protect organ function in sepsis.

Autophagy； Sepsis； Multiple organs dysfunction syndrome

2013年松江区科学技术公关项目(13SJGGYY27)

R363.1； R364.5

A

1006-2084(2015)12-2130-04

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.007

2014-07-14

2014-11-30 编辑：郑雪