骨髓间充质干细胞成骨细胞分化研究进展

王 帅(综述)，张霄雁,李哲海(审校)

(内蒙古医科大学第三附属医院骨科，内蒙古 包头 014010)



骨髓间充质干细胞成骨细胞分化研究进展

王 帅△(综述)，张霄雁※,李哲海(审校)

(内蒙古医科大学第三附属医院骨科，内蒙古 包头 014010)

骨髓间充质干细胞(BMSCs)的基础研究和临床应用广泛，BMSCs具有良好的成骨分化潜能，同时具有多向分化的能力，可向脂肪、骨、软骨细胞分化。BMSCs在合适的生长因子作用下可以快速地向成骨细胞分化和增殖，并且具有容易取材、容易分离、容易扩增、多谱系转化而不发生明显免疫排斥反应等优点，在骨组织工程领域拥有广泛的应用价值。但是，随着使用增多，存在的问题也日益突出，如生物学特性、分离鉴定、诱导分化和临床应用进展等问题还有待进一步解决。

骨髓间充质干细胞；成骨分化；组织工程

骨缺损和骨损伤是临床常见病，常需植骨治疗。对于这些损伤或疾病引起的骨缺损常依赖于异体和自体骨移植修复。自体骨移植主要缺点是供应有限，而同种异体骨主要缺点在于有致病性以及免疫原性，所以作为骨损伤修复材料不够理想。20世纪80年代组织工程的出现实现了根据骨缺损具体情况任意塑形进而达到完善形态修复的要求，为实现真正意义上的无损伤修复创伤开辟了新途径[1-2]。近年来，骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)因具备多方向分化的潜能而进行深入研究[1]。为了明确BMSCs的多向分化潜能，许多试验研究采用加入一系列诱导剂的方法，顺利地将BMSCs诱导分化为成骨细胞、神经细胞、成脂细胞等获得了较大进展[1,3-6]。它的优势逐步得到了认可，临床广泛用于骨损伤修复中[7]。现对骨髓间充质干细胞成骨细胞分化研究进展进行综述。

1 骨髓间充质干细胞的生物学特性

存在于骨髓腔中的提供造血干细胞结构和功能的结缔组织骨髓基质是由细胞间基质和基质细胞组成。虽然BMSCs取材容易，但是在骨髓中含量很低，仅为骨髓单个核细胞的0.000 1%～0.01%，所以还必须经过体外分离纯化、大量扩增才可以作为组织工程种子细胞[8]。基于目前对BMSCs的研究及认识，BMSCs主要有以下方面特征表现。①BMSCs的自我复制、增殖能力：BMSCs 在体外适宜条件培养下的自我复制、增殖与其他细胞相同，可以不断地自我更新，需通过生长滞缓期、对数增长期和生长平台期。②间充质干细胞的表面抗原标识：BMSCs的表面标识与造血干细胞的差别在于，BMSCs 没有明确的表面抗原，目前已有数个抗体可用于鉴定BMSCs，通过对分离出的BMSCs进行表面抗原鉴定，可判定所得到的细胞均一性及纯度，也可大致判断其是否来源于不同于骨髓造血干细胞的同类细胞，即BMSCs。③BMSCs的多向分化：实验证明，BMSCs具备多向分化的能力，不同的微环境可使BMSCs向不同的组织细胞分化[4]，可是经过诱导分化，细胞是否能在体内很好地归巢到指定部位，是否能有效发挥其应有的生理功能还需更进一步研究[6,9]。

2 BMSCs的分离培养及鉴定和成骨诱导

随着研究的不断深入，BMSCs 的体外分离纯化、培养扩增以及鉴定技术获得很大进展，然而，目前对于BMSCs向成骨细胞的定向诱导分化还没有形成统一的认识[10-11]。

2.1 分离BMSCs的方法 用于分离BMSCs的方法是在 Friedenstein方法上改进的。目前主要包括4种：贴壁筛选法、密度梯度离心法、免疫磁珠分选培养法及流式细胞仪分选法。可选用不同的培养基分离BMSCs，比较常用的是Dulbcco′s modified eagle′s medurn(DMEM)培养基。培养所采用的细胞密度也有所不同，经培养的BMSCs可以反复传代，并且传代后细胞保留了多向分化能力而未发生自然分化，而且经传代后，BMSCs可达到较高纯度[7]。2.2 骨髓间充质干细胞的鉴定 关于BMSCs的鉴定是个难点问题，主要原因是BMSCs的特异性表面标志物存在争议[6]。通常通过其特有的形态和可向其他基质细胞系分化的功能来识别。国际间充质及组织干细胞委员会在2006年就人来源BMSCs实验研究的鉴定提出了三条最低标准[8]：①通过标准培养，BMSCs必须具有对塑料底物黏附特性；②经使用流式细胞仪检测后，BMSCs群体阳性表达CD73、CD105、CD90，且阴性表达CD45、CD34、CD19、CD79a及人白细胞相关抗原[6,8,12]；③经体外诱导，MSCs必须能向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化[1]。比较公认的鉴定标识是BMSCs不表达淋巴细胞的表面抗原，如CD11a、CD11b等，且阴性表达造血细胞表面抗原如CD14、CD34、CD38、CD45等，但是可表达一些黏附分子，如CD29、CD44、CD166等，同时也可表达少许基质细胞表面抗原及细胞因子受体[12]。当前主要依靠形态和功能特性鉴定BMSCs[9]。

2.3 BMSCs成骨诱导

2.3.1 BMSCs分化成骨的方法 迄今为止BMSCs向成骨细胞的诱导尚未形成统一标准[1]。骨组织工程要求其向单一方向分化，所以其定向诱导调控有着重要意义。在BMSCs向骨、软骨诱导分化的过程中，作为信号物质的各种生物诱导因子参与精细调节[13]，已被确认的物理因素(超声波、生物力等)能与生物因子共同增强BMSCs成骨分化作用。现阶段诱导BMSCs分化成骨的方法主要包括以下6 种:通过细胞因子作用分化[11]、与骨细胞共同培养分化、借助化学药物作用分化、使用中药提取物作用分化、物理方法分化以及转基因作用分化。作为当前骨组织工程种子细胞，BMSCs是理想的选择，关于骨髓基质细胞诱导分化为成骨细胞的报道很多，其结果为认识诱导分化机制提供了重要指导价值。

2.3.2 BMSCs定向诱导分化为成骨细胞的影响因素 BMSCs 定向诱导分化为成骨细胞的影响因素很多，其中主要受生物、化学、物理等三大因素影响。生物因素包括各种生长因子，如转化生长因子[11]、骨形态发生蛋白[11,14]、核心结合因子1等[8]；化学因素主要是常规化学诱导剂[1]；物理因素如脉冲电磁场等。当前BMSCs定向诱导分化为成骨细胞的主要方法是化学诱导液诱导法，包括试剂地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C等[6,15]。目前的研究认为，糖皮质激素对BMSCs 向成骨细胞定向分化有促进，也有抑制作用，其主要依赖于使用剂量、作用时间、细胞种类及细胞所处阶段等[10]。有的观点[15]认为，低剂量的地塞米松可促使BMSCs向成骨细胞方向定向分化，早期主要以合成细胞基质为主，后期则以钙化为主，其作用机制可能在于地塞米松通过调节BMSCs的基因表达，促进BMSCs向成骨细胞方向分化，通过对成骨样细胞的调控影响胰岛素样生长因子合成，进而影响胶原蛋白的合成，刺激其碱性磷酸酶活性。也有学者[15]发现骨形成发生蛋白2通过不同媒介方式作用修饰成骨细胞的骨形成来增强维生素C、β-甘油磷酸钠、地塞米松等对BMSCs的成骨分化诱导能力，有数据表明[10]低剂量地塞米松保留了干细胞的增殖能力、表型以及多向分化能力，进而保留BMSCs在反复扩增过程中的干细胞源性。高浓度地塞米松不但使BMSCs增殖受到抑制，并且可促使BMSCs向成脂细胞分化。

3 成骨细胞鉴定

目前，对成骨细胞鉴定主要依赖其形态学特性及生物学特征。成骨细胞形态学观察主要靠倒置显微镜观察、扫描电镜观察及透射电镜观察。成骨细胞生物学特性主要包括以下内容。①碱性磷酸酶：成骨细胞有合成、分泌碱性磷酸酶的功能，它可直接反映成骨细胞的活性或功能状况，成熟成骨细胞内,碱性磷酸酶染色阳性[2,6,16]。目前常用的染色方法包括Gomori钙钴法、偶氮偶联法及碱性磷酸酶染色试剂盒法。②胶原蛋白：经免疫组织化学Ⅰ型胶原蛋白染色后，成骨细胞显棕色；经染色后的Ⅲ型胶原蛋白，成骨细胞偶而呈现淡棕色，这表明成骨细胞以合成Ⅰ型胶原为主[16-17]。③基质前体染色：成骨细胞合成的骨基质成分，经组织化学糖原染色后，胞质中可出现大小不等的红色团块或颗粒状物质。④成骨细胞矿化结节：成骨细胞体外矿化特征，是成骨细胞具备骨形成功能的表现，通常用Von Kossa法、四环素荧光标记法及茜素红法染色显示成骨细胞矿化结节[11,16]，四环素标记法染色呈黄色发光结节，经Von Kossa法染色矿化结节呈现黑色。并且，矿化结节计数可反映成骨细胞矿化功能[16-17]。⑤增殖率测定：通过对成骨细胞增殖率测定，反映细胞的生长情况，已被广泛应用的测定方法是MTT比色法[1]。⑥分泌蛋白测定：成骨细胞具有合成分泌多种蛋白质的功能，是典型的分泌蛋白型细胞，其中胰岛素样生长因子、骨钙素、转化生长因子、Ⅰ型胶原与成骨细胞分化以及骨形成功能密切相关[17]。⑦碱性磷酸酶比活性检测：对碱性磷酸酶比活性检测可反映成骨细胞的分化程度以及分泌碱性磷酸酶的活性[2]。⑧钙摄取功能测定：可通过放射性核素标记 45Ca2+对成骨细胞摄取和释放钙的功能进行测定[18]。⑨信使RNA测定：通过应用反转录-聚合酶链反应技术可检测成骨细胞胰岛素样生长因子、骨钙素、转化生长因子、成骨生长肽、Ⅰ型胶原等的信使RNA表达水平，进而反映成骨细胞的功能状态[8,11,17]。

4 结 语

BMSCs治疗骨缺损疾病具有独特的优越性，使其成为治疗骨科疾病合适的种子细胞，为基因治疗和细胞移植提供理想材料[2]。但关于BMSCs尚存在一些问题需要解决:①大量扩增后如何保持 BMSCs 的生物学特性[19]；②如何得到较纯的BMSCs[1,3]；③如何诱导BMSCs向特定组织细胞分化；④关于控制BMSCs过度增殖、选择适当移植时机、移植细胞可否整合到相应组织的问题上有待于进一步研究；⑤各种力学条件对BMSCs向特定组织细胞分化的影响，特别是周围环境的力作用的研究;⑥如何促使BMSCs与材料相容生长并且成骨是当前组织工程研究的焦点[5,7,20]。有关BMSCs诱导分化成骨的研究已有了较大发展，然而多数研究还处在动物体内和体外实验阶段，若对其进行充分认识，还需要临床大量的研究和人体试验。

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Research Progress on the Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Osteoblasts

WANGShuai,ZHANGXiao-yan,LIZhe-hai.

(DepartmentofOrthopedics,theThirdAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Baotou014010,China)

Basic research and clinical application of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) are extensive.BMSCs have good potential of differentiating into osteoblasts,and multipotential of differentiation ability,that they can differentiate into bone,cartilage,and adipose tissues.BMSCs can rapidly differentiate into osteoblasts and proliferate under suitable induction of growth factors.Moreover,BMSCs is easy to obtain,separate,expand,and transform of multi-spectrum without apparent immune rejection.BMSCs are the most commonly used cell sources for bone tissue engineering.However,as the application of BMSCs expands,problems such as biological characteristics,isolation and identification,induced differentiation,and clinical applicability of BMSCs are increasing and need further investigation.

Bone marrow mesenchymal stem cells; Osteogenic differentiation； Bone tissue engineering

R68

A

1006-2084(2015)12-2137-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.009

2014-08-18

2014-11-25 编辑：相丹峰