H7N9禽流感病毒基因检测技术研究进展

张 赛(综述)，陆 军(审校)

(1.安徽理工大学医学院病原学与免疫学教研室，安徽 淮南 232001； 2.滁州市疾病预防控制中心检验科，安徽 滁州 239000)



检测医学

H7N9禽流感病毒基因检测技术研究进展

张 赛1,2△(综述)，陆 军1※(审校)

(1.安徽理工大学医学院病原学与免疫学教研室，安徽 淮南 232001； 2.滁州市疾病预防控制中心检验科，安徽 滁州 239000)

2013年3月在上海和安徽两省市率先发现人感染H7N9禽流感病例，现已累计报告数百例病例。H7N9禽流感病毒因其对人类的高致病性和迅速的传播速度引起全球的广泛关注。快速、准确的检测对H7N9禽流感的疫情监测和控制极为重要。该文就目前应用于H7N9禽流感病毒研究中的基因检测技术(包括聚合酶链反应、环介导等温扩增、基因芯片、液相芯片、依赖核酸序列扩增法、高通量测序等)的研究进展予以综述。

禽流感病毒;H7N9；基因检测技术

2013年3月底，上海和安徽两地率先发现人感染H7N9禽流感病例，引发此次疫情的是一种新型重配病毒[1-3]。人感染H7N9禽流感病毒临床表现为发热、咳嗽和少痰等流感样症状[4]。目前，尚不能排除人传人的可能[5]。H7N9禽流感病毒检测是人感染H7N9禽流感防治的关键环节之一，其病原学检测实验室要求高，条件苛刻，不易普遍实施。基因检测技术具有敏感性高、特异性强、简洁、快速等优点，克服了病原学检测的局限性，为H7N9禽流感病毒检测提供了新途径。因此，基因检测技术在H7N9禽流感病毒防治中将会有更重要的应用前景。现主要对国内外检测H7N9禽流感病毒的基因检测技术进行综述。

1 聚合酶链反应

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是利用体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，在短时间内获得大量目的基因。PCR是近年来学者研究的热点之一，现已广泛应用于H7N9禽流感病毒检测，具有快捷、敏感、特异等优点。

1.1 实时反转录-PCR(reverse transcriptase PCR,RT-PCR) 近年来，以基因检测技术为基础的禽流感病毒检测方法飞速发展，实时RT-PCR是RNA病毒基因检测中使用最普遍的分子扩增法，通过扩增标本中病毒基因组RNA片段，可鉴定流感病毒并进一步亚型分析[6]，被认为是H7N9禽流感检测的金标准[5,7]。Gao等[1]利用RT-PCR在3例患者的咽拭子中提取到H7N9禽流感病毒核酸。该方法使用广泛，但反转录的DNA分子易污染实验仪器和环境，试验结果会出现假阳性和假阴性。

1.2 实时荧光定量RT-PCR 实时荧光定量RT-PCR技术在1996年由美国Applied Biosystems公司推出[8]，是在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号变化实时检测PCR扩增反应中循环扩增产物量的变化，通过循环阈值和标准曲线对起始模板进行定量分析的方法。Wong等[9]设计的“一步法”实时荧光定量RT-PCR 对H7N9禽流感病毒检测，灵敏度达到0.04 TCID50(半数组织培养感染性量)，整个检测过程只需要3 h。Zhu等[10]针对1例安徽株和2例上海株H7N9禽流感病毒的HA、NA基因序列设计特异性引物和赛博绿荧光标记探针，通过测试106拷贝/μL～10拷贝/μL系列10倍稀释的体外转录病毒，以循环阈值对应的RNA拷贝数构造标准曲线，建立以赛博绿为探针的RT-PCR检测方法；结果显示，该试验建立的H7、N9标准曲线循环阈值与对应的RNA拷贝数具有很好的线性关系，H7相关系数为0.991，N9相关系数为0.997，最低检测限为10拷贝，与Taqman探针灵敏度类似。实时荧光定量RT-PCR具有敏感性高、特异性强、快速并且可以对样品进行定量分析的优点，已大规模使用于流感监测网络实验室。

1.3 多重RT-PCR 多重RT-PCR法是在同一PCR反应体系中加入2个以上病毒亚型或多种病毒的特异性引物，利用目的片段的长度不同，可实现多个病毒亚型或多种病毒在一个反应中同时检测，是一种快速、敏感且经济有效的检测方法。罗思思等[11]针对H7N9禽流感病毒的HA、NA基因保守序列设计特异性引物和探针建立双重RT-PCR；结果显示，该方法具有快速、特异和敏感的优点，检测下限为102 拷贝/L；实现了对H7N9禽流感病毒检测的“一步法”，引物的特异性和探针的特异性保证了结果的准确性，同时比普通PCR检测技术灵敏度高100倍以上。莫秋华等[12]针对H7N9禽流感病毒的HA和NA基因设计特异性引物，选择人源基因beta-actin设计质控引物，通过优化实验条件建立“一步法”四重RT-PCR 反应体系，对混合样进行提取，没有非特异扩增产物出现，反应体系特异性强，对不同亚型病毒的检测无交叉反应，引物之间无相互干扰，对30份核酸样品经盲法试验评价与实时荧光RT-PCR检测结果完全一致，符合率为100%。

2 环介导等温扩增

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是Notomi等[13]在2000年建立的一种新型核酸恒温扩增技术，通过对靶基因的6个不同区域设计2对外引物和2对内引物，在恒温(60～65 ℃)条件下，通过链置换嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus，Bst)DNA聚合酶的作用反应l h，实现目的靶序列从很低拷贝数扩增到109拷贝数。董志珍等[14]利用LAMP检测H7N9禽流感病毒(安徽株)，其灵敏度达到10拷贝，灵敏度与实时荧光定量RT-PCR一致，该方法具有操作简单、快捷、特异性强、灵敏度高等特点，反应结果根据扩增副产物形成的沉淀肉眼直接判断。因其不依赖专门的仪器设备可在基层或小型实验室进行现场检测、临床快速诊断，是一种新型的H7N9禽流感病毒快速检测的技术与方法。Ge等[15]利用RT-LAMP对80份H7N9禽流感临床样本的HA基因和NA基因进行扩增检测，其灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均为100%。Zhang等[16]利用RT-LAMP对135例临床样本检测，试验可在12～23 min完成；H7亚型基因的检出限度为10拷贝,而其对应的N9基因检测限度为5拷贝,灵敏度是实时荧光定量RT-PCR的100倍。

3 基因芯片

基因芯片的基本原理是将RT-PCR获得的病毒基因的互补DNA(complementary DNA，cDNA)或合成的特异性寡核苷酸探针固化于芯片上，然后用不同荧光标记序列或样品(DNA或cDNA)与芯片上Cy3、Cy5标记的核酸探针标记的靶核苷酸序列进行杂交，通过对杂交信号的检测进而获取细胞或组织的大量基因信息[17]。王慧煜等[18]对29份H7亚型阳性标本进行正向杂交基因芯片检测,结果与病毒分离的结果符合率达100%。王秀荣等[19]依据M蛋白进行基因型鉴定和HA基因亚型鉴定，用Cy5荧光标记在基因芯片平台上构建检测H7亚型禽流感病毒的实验技术模型，检测H7亚型的cDNA,杂交达到预期结果。基因芯片技术具有特异性好、检测时间短等优点，但因其检测成本高、硬件要求高等缺点，在流感病毒检测中的应用还远低于其他检测方法。

4 液相芯片

液相芯片，也称为悬浮阵列、流式荧光技术，是基于美国Luminex公司研制的多功能流式点阵仪开发的多功能生物芯片平台[20]。它是通过红、绿两束激光分别检测可进行100种不同生物学反应的微球探针上的编码和报告荧光来实现定性和定量的目的，是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台，是将数字信号处理技术、流式细胞技术、激光技术及传化学技术融为一体的新型生物分子检测技术。张晓娜等[21]针对H7亚型禽流感保守基因，设计特异性引物和探针，将多重不对称RT-PCR扩增产物与偶联荧光微球的探针进行杂交,建立多重液相芯片检测方法，对50份已知病毒的样品进行液相芯片方法和禽流感检测试剂盒双盲试验，两者符合率为100%，H7亚型禽流感核酸的最低检出量为28.7 pg/μL，检测的特异性良好，且禽流感常见病毒与其他亚型无交叉反应，重复性试验的变异系数在10%以内。

5 依赖核酸序列的扩增法

依赖核酸序列的扩增法(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)是一项以RNA为模板无需反转录的快速等温扩增技术，赖于鸟类成髓细胞瘤病毒反转录酶、噬菌体T7RNA多聚酶、核糖核酸酶H、两种特别设计的特异性寡核苷酸引物和分子信标探针共同协作而完成。Collins等[22]基于M基因和H7亚型的HA基因已成功开发出可检测禽流感群特异性H7亚型(NASBA-H7)的NASBA/ECL(电化学发光)检测试剂盒，检出时间只需6 h，比商品化的免疫检测试剂盒敏感至少高1000倍，比常规PCR方法也敏感许多，与现行病毒培养的检测方法灵敏度相当,可准确无误地检测出病毒。该方法的优点是RNA分子不易对实验仪器和环境造成污染，避免了试验结果的假阳性，缺点是检测成本过高。

6 高通量测序

高通量测序又名下一代测序，是将目标DNA剪切为小片段结合到固相表面进行独立扩增，每次只复制1个碱基(A、C、T、G)，通过高分辨率的成像系统检测信号。赵康辰等[23]以U12引物反转录cDNA,通用流感病毒全基因扩增引物混合物生成双链cDNA制备高通量测序模板对8份样品进行检测，从模板制备、文库构建到序列及数据分析等在2 d内完成；该方法不需要进行PCR扩增，病毒RNA可直接制备测序模板，测序模板用量只需要1 ng的双链cDNA，具有准确性高、周期短、可同时对多个样本进行检测且成本相对较低等优点，使大规模H7N9禽流感病毒基因组检测变为现实。

7 小 结

H7N9禽流感疫情爆发让公众的眼光再次聚焦于流感实验室诊断。基因检测技术为H7N9禽流感提供了高灵敏度、强特异性且快速的诊断，为疫情的控制提供了宝贵的时间和准确的流行病学信息，避免了疫情的大规模蔓延。但基因检测技术并不能解决所有问题，有一定的局限性。因此，在H7N9禽流感病毒的检测过程中，要不断探索不同检测技术及不同学科之间的融合，取长补短，推进H7N9禽流感病毒基因检测技术进入新的发展阶段。

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Advance in Gene Techniques for Detection of Avian Influenza A (H7N9) Virus

ZHANGSai1,2,LUJUN1.

(1.DepartmentofAetiology&Immunology,MedicalCollege,AnhuiUniversityofScience&Technology，Huainan232001,China; 2.DepartmentofCentralLaboratory,ChuzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Chuzhou239000,China)

In March 2013,cases of avian influenza A(H7N9) infection have been firstly found in Shanghai and Anhui,and there has been hundreds of cases reported so far.The influenza A(H7N9) is a pathogen with highly pathogenicity to human and able to spread rapidly,which has attracted global attention.It is very important to establish a rapid and sensitive method for avian influenza A(H7N9) detection and control.Here is to make a review of the gene techniques used in detection of avian influenza A,including polymerase chain reaction,loop-mediated isothermal amplification,gene chip,liquid chip,nucleic acid sequence-based amplification and high-throughput sequencing.

Bird flu virus; H7N9; Gene detection techniques

R373.13；R511.7

A

1006-2084(2015)12-2226-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.042

2014-10-10

2014-12-18 编辑：郑雪