脑缺血/再灌注损伤细胞凋亡中JNK信号通路及抑制剂SP600125的作用

许秀洪,吴春晓，王　娇(综述)，周国平(审校)

(南方医科大学中医药学院，广州 510515)



脑缺血/再灌注损伤细胞凋亡中JNK信号通路及抑制剂SP600125的作用

许秀洪△,吴春晓△，王娇△(综述)，周国平※(审校)

(南方医科大学中医药学院，广州 510515)

摘要：c-jun氨基末端激酶(JNK)信号转导通路是细胞内作用蛋白网络的重要一环，参与胞外信号从细胞表面转导到细胞内部的过程，可被多种因素激活，在细胞的增殖与分化、形态维持、骨架构建和细胞凋亡等生物反应过程中发挥重要作用。脑缺血/再灌注损伤导致的细胞凋亡与丝裂原活化蛋白激酶家族有密切的关系，其中JNK信号通路是脑缺血/再灌注损伤中神经元凋亡进程的主要机制之一。大量实验提示，JNK信号转导通路及其抑制剂SP600125在脑缺血/再灌注损伤诱导的细胞凋亡中起重要的调控作用，应用JNK阻断剂可起到神经保护作用，通过对这些信号转导通路的组成及调节机制的研究，有望为临床上脑缺血疾病的治疗提供新的分子治疗靶点。

关键词:脑缺血/再灌注损伤；丝裂原活化蛋白激酶信号通路；c-Jun氨基端激酶信号通路；细胞凋亡

脑缺血是导致人类死亡和残疾的最常见原因之一，目前已知脑梗死后50%以上的梗死血管可以自发再通，而再通后的再灌注损伤的机制一直是研究的热点，当各种原因导致的局部脑组织区域血液供应障碍并恢复血流再通时，脑内的细胞受到这种缺血/再灌注的刺激后产生一系列病理生理反应,如细胞内钙离子超载、兴奋性氨基酸发生毒性作用、自由基大量生成、炎性细胞因子产生损伤、相关基因表达异常等[1-2]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号转导通路是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号转导通路中重要的通路之一，参与多种生理病理过程，在脑缺血/再灌注损伤细胞的程序性死亡过程中JNK信号通路也起重要的调节作用[3]。现就JNK信号通路的机制在脑缺血/再灌注过程中的作用及阻制剂的应用进行综述。

1细胞凋亡与MAPK家族

在缺血/再灌注后2～4 d后会引起海马、皮质等区域神经元的细胞死亡，这种现象称为迟发性神经元死亡。各种实验证明，脑缺血/再灌注损伤所引起的迟发性神经元的死亡主要是通过细胞凋亡完成的[4-5]。细胞凋亡是由于细胞受到各种因素刺激而激发细胞自身自杀程序的一种死亡方式，这种死亡方式受到细胞内活性基因、酶和信号转导通路的调控，是细胞主动死亡的过程，也称程序性死亡。实验表明，MAPK级联途径参与脑缺血/再灌注损伤，在细胞凋亡的信号转导方面起关键性作用，有细胞质和细胞核联系枢纽之称[6]。在真核生物中，MAPK家族中最具特征的主要通路如下。①细胞外信号调节蛋白激酶信号通路：对酪氨酸激酶受体、生长因子受体反应。②p38MAPK通路：对热休克、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)等反应。③JNK信号通路：对 TNF-α、IL-1和热激反应等反应[7]。在脑缺血/再灌注时这三条主要信号通路均被激活。JNK是MAPK级联途径中的一条重要通路，在脑缺血/再灌注损伤中神经元的凋亡进程中起重要的调节作用[8]。

2JNK信号通路概述

JNK是应激激活的蛋白激酶之一,是进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是MAPK家族的重要成员，于1991年提出，当时研究者用紫外线照射细胞后，一种蛋白激酶能使c-Jun 氨基末端活性区丝氨酸第63和第73位发生磷酸化，因此把该蛋白激酶命名为JNK,至今研究发现JNK存在10个异构体，编码JNK信号转导通路的基因包括jnk1、jnk2和jnk3[9]。这三个基因通过选择性剪切形成相对分子质量为46 000 的JNK1α、JNK2α和54 000的JNK1β、JNK2β以及48 000 的JNK3α、57 000的JNK3β。JNK3由于有一个扩展的N端，其相对分子质量要比相对应的JNK1和JNK2大，因此JNK3主要特异表达在心脏、脑、睾丸等部位，而JNK1和JNK2广泛表达于各组织中[10]。

JNK信号通路主要参与细胞骨架构建、细胞形态维持，细胞增殖与分化、细胞恶变和细胞凋亡等各种生物学反应。其中JNK参与的细胞凋亡作用主要是缺血/再灌注损伤的机制之一。经典的JNK信号转导通路调节细胞凋亡，大致模式归纳为：胞外刺激-生发中心激酶-JNK上游信号促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAPKKK)-促分裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MAPKK)激酶-JNK-下游靶基因-细胞凋亡，其中胞外刺激主要是指JNK信号通路可被表皮生长因子、细胞因子(TNF-α、IL-1)、应激(如渗透压、氧化损伤、电离辐射和热休克)及G蛋白偶联受体激活[11]。胞外的刺激进一步激化了JNK的上游信号，即MAPKKK-MAPKK，MAPKKKs 激酶主要包括ASKs、MEKKs、MLKs、TAK等，MAPKKs 包括MKK4、MKK7。其中MKK4、MKK7两者均为双特异性激酶，对苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化具有选择性，研究表明单独敲除MKK4或MKK7基因可部分丧失应激刺激后的JNK激活，同时敲除两个基因则JNK完全不能激活[12]。通过JNK激酶的一系列激活后，JNK信号通路主要通过以下两条途径作用于下游靶细胞进而导致细胞凋亡。①外源性途径(死亡受体途径)：通过磷酸化c-Jun氨基末端第63与第73位的丝氨酸并将JNK从胞质转移到细胞核内，进而活化c-Jun和激活转录因子2激活转录因子复合物活化蛋白1(activator protein-1,AP-1)，诱导多种凋亡蛋白表达，如肿瘤坏死因子、Bax、p53、FasL等，使表达增强,导致细胞凋亡，主要通过上调凋亡蛋白促进细胞凋亡。②内源性途径(线粒体途径)：主要通过参与线粒体介导细胞的凋亡通路，活化的JNK通过刺激下游底物改变线粒体通透性转换孔的通透性，通过磷酸化B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)进而促进线粒体释放细胞色素C，从而激活胱天蛋白酶9-胱天蛋白酶3(caspase9-caspase3)级联反应，诱导细胞凋亡[13]。

3JNK信号转导通路在脑缺血损伤神经元凋亡中的作用

脑缺血/再灌注损伤后JNK激活引起脑缺血半暗带区神经细胞延迟性死亡的作用机制目前主要存在以下两种：①通过线粒体途径的激活引起细胞色素C、Smac的释放，进而激活凋亡执行蛋白caspase-3引起凋亡；②通过转录和翻译后机制活化的JNK激活c-Jun/AP-1后引起凋亡相关基因表达的变化，如Bbax、Bim基因等[14]。也有研究表明[15],脑缺血/再灌注损伤后广泛的MAPK的激活引起细胞炎性介质的释放和表达量的上调，如IL-1、TNF-α等。它们在脑缺血/再灌注损伤后引起强烈的炎症反应，破坏细胞膜的完整性，引起细胞的死亡和凋亡。田艳霞等[16]对大鼠进行可逆性大脑中动脉栓塞模型，采用免疫印迹法检测大脑缺血/再灌注大鼠海马区磷酸化c-Jun及凋亡caspase-3表达,结果表明脑缺血/再灌注诱导了磷酸化c-Jun的早期表达，其中在脑缺血/再灌注3 h表达明显增加，一直持续到12 h仍高于正常基础水平，提示在脑缺血/再灌注损伤中存在JNK的过度激活，在实验进行到12～24 h阶段也可发现逐渐增加的凋亡细胞出现在海马CA1区，进一步证明JNK信号通路的激活可诱导神经元细胞发生凋亡的结论。王宁等[17]观察假手术组、缺血/再灌注组大鼠JNK信号通路JNK表达的比较发现，海马CA1区磷酸化c-Jun在缺血/再灌注组表达明显,于再灌注2 h时明显升高,6 h时稍有降低,后逐渐上升，24 h表达到高峰。Okuno等[18]研究发现，大脑中动脉线栓法后1 h大脑中动脉区活化JNK增加，运用JNK选择性抑制剂SP600125，采用原位末端转移酶标记技术染色及相关凋亡DNA片段分析，发现SP600125抑制了脑缺血/再灌注诱导的神经元凋亡，而且可以阻断细胞凋亡因子Bax从胞质转入线粒体，表明JNK的激活可以导致脑缺血后的神经细胞凋亡。同样，Gao等[19]使用小鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型，应用蛋白免疫印迹技术和检测酶活性的方法发现JNK在脑缺血/再灌注损伤后活性发生变化，应用蛋白免疫印迹技术定量分析发现在脑缺血/再灌注后30 min磷酸化MKK4和磷酸化c-Jun的表达量都显著提高，一直到脑缺血/再灌注后24 h才恢复到对照组水平。研究也表明，JNK的下游底物c-Jun的磷酸化在脑缺血/再灌注1 h后增高，在脑缺血/再灌注后1 d其活性仍然较高,说明局灶性脑缺血/再灌注损伤后激活了MKK4/JNK/c-Jun信号转导通路。

4JNK抑制剂SP600125在脑缺血损伤中的作用

SP600125为2001年发现的一种JNK的竞争性ATP特异性抑制剂，又称为Anthrapyrazolone，分子质量为220.23，可溶解于二甲基亚砜(溶解度约为15 000 mg/L)，不溶于水，能阻断所有亚型JNK的催化区域，可逆性地抑制JNK活性，对JNK的抑制要比对细胞外信号调节蛋白激酶1和p38的抑制高300多倍，可显著抑制c-Jun磷酸化，抑制TNF-α、干扰素γ、 环加氧酶2和IL-2等的表达[20-21]。曹磊等[22]应用四血管阻断法建立大鼠脑缺血模型，造模前用SP600125抑制剂作预处理，结果发现经SP600125处理后的大鼠凋亡细胞数目显著低于脑缺血/再灌注组，说明抑制剂对神经元损伤具有保护作用。纵雪梅等[23]通过测定海马Bax和Bcl-2蛋白表达阳性细胞数量、CA1区存活锥体细胞数量，结果显示，经阻滞剂处理后存活细胞数和Bcl-2阳性锥体细胞数较脑缺血/再灌注组多，Bax阳性锥体细胞数目增加较少，推断阻制剂SP600125能保护神经元，且可能是通过调控Bax和Bcl-2的蛋白表达实现的。Chen等[24]发现，JNK的磷酸化在海马水平表达升高，而这种激酶的磷酸化可被JNK抑制剂SP600125抑制，也证实JNK特异性抑制剂SP600125对短暂脑缺血/再灌注诱导的海马CA1区神经元死亡的保护作用。Guan等[25]在大鼠的全脑缺血/再灌注模型中应用抑制剂SP600125，明显减少脑缺血/再灌注后海马CA1区神经细胞的凋亡，推测SP600125通过减少磷酸化的c-Jun和FasL的表达，抑制Bcl-2的磷酸化和Bax从蛋白二聚体Bcl-2/Bax的释放，减弱Bax转位到线粒体以及细胞色素C的释放并且抑制细胞凋亡的效应器caspase-3而起作用。王宁等[26]应用SP600125抑制大鼠全脑缺血模型后JNK的活性发现,大鼠脑缺血/再灌注后海马CA1区神经元凋亡的数目显著较对照组少，存活神经元的数目显著较对照组多，其机制可能为降低了DNA修复蛋白X线修复交叉互补蛋白1的表达来维护DNA修复功能，而减少神经元的凋亡。Benakis等[27]在大鼠脑缺/血再灌注模型建立3 h后应用JNK抑制剂减少缺血/再灌注后48 h梗死体积下降约15.9 mm3。Gao等[19]应用局灶性脑缺血/再灌注模型研究发现,JNK在脑缺血后30 min至24 h活性增加，分别应用SP600125后不但减弱JNK活性，而且也显著减少脑缺血后脑梗死灶的面积，同时显著改善大鼠的神经系统功能评分及感觉功能障碍，另外发现再增加SP600125的应用剂量以及在脑缺血后2 h以上应用SP600125对脑梗死灶体积的减少效果均不显著。在脑缺血前30 min在侧脑室注射JNK的抑制剂后能显著减少脑梗死灶的体积[从(45.3±11.4) mm3减少到(25.2±9.1) mm3]。以上的研究都说明，JNK抑制剂在脑缺血/再灌注损伤中有神经保护作用，目前JNK在脑缺血/再灌注损伤中的神经保护方面的作用机制尚未完全阐明，但是应用JNK阻断剂抑制其活性从而达到神经保护作用的目的。

5结语

缺血性脑卒中是威胁人类生命的高致残、致死性疾病，关于缺血性脑损伤的机制和防治措施一直是研究的热点和重点。在脑缺血/再灌注时，JNK信号转导通路被激活，虽然有研究提示JNK信号转导通路在脑缺血/再灌注损伤过程中的作用是双向的，但多数实验证明应用JNK阻断剂可以起到神经保护作用，因此通过对这些信号转导通路的组成及调节机制的研究，有望为临床上脑缺血疾病的治疗提供新的分子治疗靶点。

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Effects of JNK Signaling Pathway and SP600125-JNK Inhibitor in Apoptosis on Brain Ischemia ReperfusionXUXiu-Hong,WUChun-xiao,WANGJiao,ZHOUGuo-ping.(SchoolofTraditionalChineseMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Abstract:c-Jun N-terminal kinase (JNK) signal pathway is one of the most important aspects of protein network in the cell and participates in the extracellular signal transduction from the cell surface to the internal process,could be activated by a variety of factors and played a role in cell proliferation and differentiation,cell maintaining,skeleton building and apoptosis.Cerebral ischemia-reperfusion injury would cause apoptosis,which are closely related with the MAPK family.Besides,JNK signaling pathway is one of the main mechanisms of neuronal apoptosis process which caused by cerebral ischemia-reperfusion injury.Many studies show that JNK signal pathway and SP600125-JNK inhibitor plays an important regulation role in in apoptosis on brain ischemia reperfusion.Experimental results demonstrate that the application of JNK inhibitor may play a neuroprotective effect.To study the composition and regulation mechanisms of these signaling pathways,which are expected to provide new molecular therapeutic targets for the clinical treatment of cerebral ischemic diseases.

Key words:Cerebral ischemia-reperfusion injury; Mitogen-activated protein signaling pathway; c-Jun N-terminal kinase signal pathway; Apoptosis

收稿日期：2014-05-04修回日期：2014-08-25编辑：鲍淑芳

基金项目：国家自然科学基金(81173355)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.09.007

中图分类号:R332； R322.61

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)09-1554-03