蓝莓组织培养技术研究进展

于巧芝，赖钟雄

（福建农林大学园艺学院，福建福州350002）

蓝莓组织培养技术研究进展

于巧芝，赖钟雄*

（福建农林大学园艺学院，福建福州350002）

综述了目前国内蓝莓组织培养技术的研究状况，介绍了蓝莓组织培养过程中不同外植体无菌体系的建立、外植体培养、试管苗生根培养等方面的技术，并对蓝莓组织培养中的问题进行了分析，最后对组织培养技术在蓝莓栽培中的应用进行了展望。

蓝莓；组织培养；应用

蓝莓（blueberry）又称越橘、蓝浆果，属杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vacciniodeae）植物，起源于北美，为多年生灌木小浆果果树。因其含有大量的花青素，是近年来研究的热门水果[1-2]。蓝莓果实中含有丰富的营养成分，具有防止脑神经老化、强心、抗癌、软化血管、增强人机体免疫等功能，被国际粮农组织认定为五大健康食品之一。目前我国国内市场上的蓝莓制品种类不断增加，销量也呈增长趋势。传统的蓝莓产区——北美产区的产量已远不能满足本地和世界市场的需求，因此世界上许多国家已先后引种。近年来，我国蓝莓的种植面积日益扩大[3]，但常规栽培方式培养周期长，生产效率较低，而运用组织培养技术可提高蓝莓的生产效率，缩短培养周期，培育无病毒植株。现对近几年来国内对蓝莓组织培养技术的研究进展进行较系统性的综述，为蓝莓组织培养技术的进一步探究提供参考。

1 外植体的采集和处理

1.1 取材

蓝莓的各个器官都可用作组织培养中的外植体材料，如种子、休眠枝条、成龄的茎段或茎尖，以及一些去除叶柄和叶端边缘的叶片。在试验过程中，通常采用的材料以成年植株上取得的茎段和茎尖组织为主，其增殖率相对较高，易成活，操作简便。也有试验证实带叶柄的叶片出芽率最高。

另外，不同的取材时间对蓝莓的增殖也有一定影响。王连润等[4]在试验中，选取蓝莓当年10月生、生长健壮、无病虫害的枝条，剪成3～4 cm茎段进行试验，结果表明生长势健壮、带隐芽的茎段污染率较低。Sidorocich等通过对一年当中不同时期的蓝莓试材进行组织培养研究发现，4月份为最佳的取材时

期，此时的茎段产生愈伤组织相对较少，生长相对较快，芽更易分化且褐变现象明显减少[5]。

1.2 消毒

在对外植体进行消毒时，不同种类的外植体所使用的消毒方法不同，消毒剂的种类以及消毒时间和消毒剂所使用的含量也会影响消毒效果，从而影响外植体的污染率。在蓝莓组织培养过程中用到的消毒药剂通常有：含2%次氯酸钠溶液、0.1%升汞溶液和12%H2O2溶液等，所使用的量和消毒时间也有一定的差异。根据已有报道，外植体消毒方法为：灭菌之前用洗衣粉浸泡外植体，并用流水冲洗数分钟，然后用乙醇对材料进行预灭菌，使用浓度一般为70%～75%，灭菌时间为30～600 s；升汞的使用浓度0.1%，灭菌时间为5～10 min，当灭菌时间超过10 min时，会对蓝莓外植体产生毒害作用，造成外植体死亡[6-17]。陶兴魁等[18]认为用2%的NaClO将蓝莓外植体浸泡10 min，有利于降低外植体的污染率。12%双氧水处理10 min和升汞双次灭菌法常用于蓝莓叶子灭菌。王连润等[14]研究认为，用带隐芽的健壮材料建立无菌苗，污染率最高不超过8%，成苗率高，90%以上的芽能抽梢形成正常的绿苗。

2 外植体的培养

2.1 基本培养基的选择

已有研究报道，蓝莓茎段培养所用过的基本培养基有MS、1/2MS、White、WPM、改良WPM、knops培养基和B5等几种。1983年Wolfe比较了7种培养基，发现WPM（Woody Plant Medium）培养基效果最好[19]。在制备培养基时，用Ca（NO3）2·4H2O 684 mg/L、KNO3190 mg/L、C10H13FeN2NaO873.4 mg/L和盐酸硫胺素0.1 mg/L，取代原WPM培养基中的K2SO4、CaCl2、FeSO4和Na2EDTA，称为改良型的WPM。刘庆忠[8]、郝明明等[20]在用改良WPM培养基培养蓝莓时，获得良好效果。但由于蓝莓品种的不同，所需要的营养也会有相应的差异，所以在培养基选择的过程中应根据需要进行选择，不能照搬他人的研究结果。马艳丽[13]研究得出，对于高丛蓝莓，用改良MS培养，最高再生率可达75%；廉家盛等[21]研究得出B5培养基最适合“美登”蓝莓不定芽增殖生长，而对兔眼蓝莓用改良knops培养最合适，可达到将近85%的增殖率。目前大部分研究者都使用改良的WPM作为蓝莓组织培养的基本培养基。

2.2 激素种类和浓度

基本培养基只能维持外植体基本的生存，如果想要获得更加优质的培养效果，需要按照需求添加不同的植物生长调节剂来促使其分化成健壮的试管苗。而决定植物形态发生启动和分化方向重要的2个因素是植物激素的种类和浓度的配比。对于玉米素ZT的浓度，聂飞等[11]的研究表明，选用ZT 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L均能诱导丛生枝，几种浓度条件下蓝莓的繁殖系数相差不大，ZT 0.5 mg/L时，出现4～6个新生枝，节间长0.6～0.8 cm，苗高达到0.6～2.0 cm，4～8枚叶片，无枯梢现象，但新生枝数目仅为添加ZT 1.0 mg/L时的一半，20 d后将ZT恢复到1.0 mg/L时，增殖新生枝8～15个，因此，2种浓度可交替使用。在改良的WPM培养基上经4周培养，叶片与叶柄交界处4～6个小枝被诱导出，转接到含ZT 0.5和1.0 mg/L的培养基上交替培养，新生枝增殖倍数将会保持在6倍以上[20]。在以茎尖为外植体的研究过程中，董朝莉[10]采用改良WPM为基本培养基，研究越橘的组培育苗技术，结果表明，以兔眼越橘当年生绿枝茎段为外植体可有效获得无菌苗；越橘茎段的离体增殖率受到培养基中细胞分裂素的调控，ZT 1～2 mg/L和2ip 10～20 mg/L的效果较好。宁志怨等[22]在越橘丛生芽的诱导上利用改良MS+2 mg/L ZT+0.2 mg/L NAA的增殖培养基，经过2次继代培养后越橘的增殖系数可达30～50倍。刘树英[17]对Gardenblue等7个兔眼越橘的研究表明，茎段芽的萌发生长适宜的激素配比为15 mg/L 2ip+0.02 mg/L NAA，并且2ip的浓度为15 mg/L、ZT的浓度为3 mg/L时对芽的萌发有利。在对蓝莓外植体进行培养的过程中，选择合适的培养基种类以及适当的激素配比，对蓝莓的增殖生长有明显影响。

2.3 培养条件

一般的培养条件为在基本培养基中添加蔗糖20 mg/L、琼脂6～8 g/L，用1 mol的NaOH调节pH至4.8左右；培养基在121℃、131 kPa的条件下灭菌不超过20 min。接种后培养温度为25℃左右，光强度为2 500 lx，光周期为16 h黑暗、8 h光照的条件。刘树英等[17]研究发现，光照强度为3 000和4 000 lx为芽增殖的最适光强，芽增殖数量多且增殖系数分别达4.0和4.5；还指出pH为5.4时培养生长长度达7～9 cm。研究表明，在组织培养前进行暗培养可增加越橘不定芽的诱导率。Rida[23]以越橘叶片进行培养

前，以黑暗条件下预培养2周，大大提高了不定芽的诱导率。pH低于5.2或高于5.3均不利于丛生芽的诱导，表现低分化率，且死亡数目很多，适当的pH对丛生芽的诱导非常重要[19]。

3 外植体的生根培养

3.1 试管苗瓶内生根

蓝莓属于越橘属植物，因其没有侧根，一般根系较弱。大量试验表明，蓝莓在组培苗瓶内生根速度慢，生根率低，并且生长势弱，根较细，所以蓝莓不适宜在试管内生根。王连润等[14]研究发现，蓝莓在改良的1/2WPM基本培养基添加0.3 mg/L IBA的生根培养基上光照培养20 d后，生根率不到5%，培养60 d后生根率才达70%～90%。国内大量研究表明，以1/2 WPM培养基对蓝莓生根培养效果相对较好。王平红等[24]以改良1/2 WPM作为基本培养基添加0.6 mg/L IBA，试管苗在45 d左右开始生根，生根率可达75.3%。不同品种的蓝莓瓶内生根培养有一定差异。孙书伟以1/2 WPM为基本培养基，对蓝丰、伯克利组培苗的生根技术进行了研究，结果表明蓝丰在0.1 mg/L IBA的培养基上，生根数量和生根率最好，28 d的生根率达100%，而伯克利在添加0.05 mg/L IBA的培养基上，32 d时生根率达100%，取得了理想的效果[25]。2011年，关丽霞建立了蓝莓组培苗瓶内浅层液体生根技术体系，使得生根率达到了96.5%以上[26]。

3.2 试管苗瓶外生根

由于蓝莓在试管内生根的效果不佳，无法满足生产需求，所以在对蓝莓微体繁殖研究时，一般均在试管外生根或在弥雾条件下扦插试管幼枝生根[27]。在扦插生根中，一般以苔藓作为扦插基质，生根率较高。苔藓用500倍多菌灵溶液浸泡捞出后稍沥干水分，铺到事先准备好的苗床上，压平压实，苔藓厚度5～7 cm。将复壮的组培苗剪成2 cm左右，速蘸100 mg/LIBA溶液后，扦插于经灭菌处理的苔藓基质苗床上，空气湿度保持95%以上，2周后相对湿度85%～90%，温度保持在20～28℃。40 d生根成活率可达70%～80%；90 d后，生出大量不定根，长度可达30 cm[28]。在对高丛越橘的研究中，在生根培养基上培养30 d，可将生根的试管苗或未生根的新梢移栽进行栽培，移栽基质为1∶1的草炭土与河沙。移栽后将小拱棚密闭，可达到保湿作用，封闭40 d后，越橘苗达到并恢复长势较好状态后慢慢通风，1个月浇2次0.5%的FeSO4溶液，成活率可达50%以上[18]。基质的差异对扦插苗瓶外生根率影响较大，研究表明，苔藓是其扦插生根的最优基质；NAA和IBA各1 000 mg/kg按1∶1混和处理时获得最佳生根率为85%，根系总长度接近700 cm。根据不同品种的蓝莓选择适宜的生根基质，可提高试管苗的生根率[29]。

4 存在的问题及展望

目前，国内外对蓝莓生产的研究已大大加快。我国已发现的越橘属植物已有90多种，运用组织培养技术，对我国蓝莓种质资源的保存和开发利用有着重要意义。与常规育苗方法相比，组织培养育苗可大大缩短培养周期，在操作上更加简便，并能培育出健壮整齐的组培苗。而且对蓝莓组培苗进行脱毒培养，可获得大量优质的种苗，并且不受季节地域的限制。通过建立起一套完整的组织培养体系，可为蓝莓的工厂化育苗提供相应的理论基础，为国内的蓝莓市场提供新的技术指导。开展蓝莓组织培养研究，为保存不同基因型蓝莓的优良性状提供了技术支撑，有利于优良种质资源的保存，为优化的再生体系建立提供了保障。虽然近年来蓝莓组织培养技术取得了显著进展，但在实际生产操作中仍旧存在一些问题：①在组织培养过程中，污染率仍然较高，分化率、成活率、生根率仍然有待提高；②不同品种蓝莓的培养条件缺少一套合理的系统依据，需要进一步进行有规律性的深化研究，归纳出完整的理论支撑；③对蓝莓组织生理机能的研究也有待进一步深化。

在今后蓝莓组织培养的研究中，要继续完善其技术方法，在不同品种间归纳出一套完整的理论依据，重点放在离体再生体系和转化体系的研究，为基因的优化、优良种植资源的保存提供技术支撑。蓝莓再生植株的发生机理和基因转化育种等方面也具有极大的研究前景。

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（责任编辑 金苹）

Research Progress of Blueberry Tissue Culture Technology

YU Qiao-zhiet al.(College of Horticulture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002)

Research status of blueberry tissue culture technology in China was summarized,and the establishment of the sterile system of different explants,explant culture and tube seedlings rooting culture in the process of blueberry tissue culture were introduced.The problems exiting in blueberry tissue culture were analyzed,at last,the prospect of the application of tissue culture technology in blueberry was given.

Blueberry;Tissue culture;Application

Q813.1

A

2095-0896（2015）06-079-03

于巧芝（1991-），女，河北石家庄人，本科生，专业：园艺。*通讯作者，研究员，博士生导师，博士，从事园艺植物生物技术与遗传资源研究。

2015-04-21