环丙沙星与乳铁蛋白多肽嵌合体联用对铜绿假单胞菌生物膜及密度感知系统信号分子生成的抑制作用*

左鹏，王爱利，王正云，徐国鹏，胡琼洁，邵冰，徐西琳，熊维宁，熊盛道

(华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸与危重症医学科，武汉 430030)

·抗感染用药专栏·

环丙沙星与乳铁蛋白多肽嵌合体联用对铜绿假单胞菌生物膜及密度感知系统信号分子生成的抑制作用*

(华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸与危重症医学科，武汉 430030)

目的 比较环丙沙星(CIP)、乳铁蛋白多肽嵌合体(LFchimera)单用及二者联用对铜绿假单胞菌生物膜及密度感知(QS)系统信号分子(AHL)生成的抑制作用。方法 以铜绿假单胞菌野生菌株PAO1为实验菌株，分为对照组(未干预的铜绿假单胞菌野生菌株PAO1)、CIP(0.04 μg·mL-1)组、LFchimera(0.25 μmol·L-1)组、LFchimera(1.00 μmol·L-1)组、CIP(0.04 μg·mL-1)+LFchimera(1.00 μmol·L-1)组，分别定量测定并比较各组PAO1生物被膜和QS系统信号分子表达。结果 与对照组PAO1生物膜定量表达(A590)(1.511 3±0.031 8)及QS系统信号分子表达(A420)(0.502 5±0.028 3)比较，CIP(0.04 μg·mL-1)组(1.073 3±0.010 9，0.245 3±0.014 0)、LFchimera(0.25 μmol·L-1)组(1.065 5±0.011 4，0.235 9±0.010 7)、LFchimera(1.00 μmol·L-1)组(0.665 3±0.012 9，0.108 6±0.007 0)和CIP(0.04 μg·mL-1)+ LFchimera(1.00 μmol·L-1)组(0.122 1±0.013 0，0.048 2±0.005 4)均下降(均P<0.05)；CIP(0.04 μg·mL-1)组和LFchimera(0.25 μmol·L-1)组比较，PAO1生物膜定量表达和QS系统信号分子表达差异无统计学意义(P>0.05)；LFchimera(1.00 μmol·L-1)组PAO1的生物膜定量表达和QS系统信号分子表达较LFchimera(0.25 μmol·L-1)组和CIP(0.04 μg·mL-1)组均降低(均P<0.05)；CIP(0.04 μg·mL-1)+LFchimera(1.00 μmol·L-1)组和各单独用药组比较，PAO1生物膜的定量表达和QS系统信号分子表达均下降(均P<0.05)。结论 亚抑菌浓度的CIP 和LFchimera都对铜绿假单胞菌生物膜的形成和QS系统信号分子的生成有抑制作用，且提高LFchimera浓度可加强抑制作用；CIP与LFchimera联用能增强抑制作用，这种作用可能是通过抑制QS系统信号分子的生成实现。

环丙沙星；乳铁蛋白；铜绿假单胞菌；生物膜；密度感知系统

铜绿假单胞菌是医院内感染的重要病原菌[1]，其致病机制与细胞相关性毒力因子和分泌性毒力因子有关，例如其产生的弹性蛋白酶、胞外酶S、磷脂酶C和绿脓菌素等[2- 3]，它们的表达都受密度感知(quorum sensing，QS)系统调控。铜绿假单胞菌耐药机制包括多个方面，其中之一是铜绿假单胞菌可以在细菌表面形成一层生物膜，不易被抗菌药物渗透和杀灭，从而引起感染反复发作，而生物膜的形成也与QS系统密切相关。乳铁蛋白多肽嵌合体(lactoferrin-derived peptides chimera，LFchimera)对铜绿假单胞菌具有杀菌作用，同时可以抑制生物膜及QS系统相关毒力因子的生成[4]，那么在临床上被公认的具有抗铜绿假单胞菌作用的喹诺酮类药物环丙沙星(ciprofloxacin，CIP)与LFchimera联用是否也有类似的甚至更强的的作用，目前国内外报道甚少。因此，笔者以LFchimera为对照进一步研究CIP与LFchimera联用对铜绿假单胞菌生物膜及QS系统信号分子酰化高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserinelactone，AHL)生成的影响，为临床治疗铜绿假单胞菌感染提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 本研究所用铜绿假单胞菌野生菌株PAO1来自华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科微生物室；Escherichia coli(E.coli)MG-4(pKDT17)由本实验室保存(系由华盛顿大学的 Greenberg教授惠赠)。

1.2 试剂 LFchimera(杭州中肽生化有限公司合成)；CIP、邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)购自美国Sigma公司；胰蛋白胨、细菌蛋白胨、蛋白胨、胰酶大豆肉汤、酵母提取物均购自美国BD公司；其余试剂均为国产分析纯。本实验室自行配制：溶菌肉汤(lysogeny broth,LB)培养液(10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母提取物，10 g·L-1氯化钠)；LB固体培养基(10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母提取物，10 g·L-1氯化钠，15 g·L-1琼脂)；1 mmol·L-1磷酸钾缓冲液(0.140 g·L-1磷酸氢二钾，0.052 g·L-1磷酸二氢钾)。

1.3 仪器 高速冷冻离心机(Centrifuge 5810R，德国Eppendorf公司；Universal 32R，德国Hettich Zentrifugen公司)；台式恒温振荡器(培英THZ-D型，江苏省太仓市实验设备厂)；Sunrise酶标仪(瑞士Tecan公司)；Elx800酶标仪(美国Bio-Tek公司)；细菌培养箱(WGP-350型隔水恒温培养箱，上海安亭科学仪器厂)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9140A型，上海精宏实验设备有限公司)；紫外分光光度计(DU-640型，美国Beckman公司)；低温冰箱(MDF U50V 型，日本Sanyo公司)。

1.4 方法 以铜绿假单胞菌野生菌株PAO1为实验菌株，分为对照组(未干预的铜绿假单胞菌野生菌株PAO1)、CIP(0.04 μg·mL-1)组、0.25 μmol·L-1LFchimera组、1.00 μmol·L-1LFchimera组、CIP(0.04 μg·mL-1)+LFchimera(1.00 μmol·L-1)组，然后分别定量测定各组PAO1的生物膜和QS系统信号分子的表达，并进行比较。

1.4.1 生物膜定量检测 生物膜的形成是通过检测细菌在聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)培养板表面生长黏附的能力进行定量的[5-6]：取-80 ℃冻存PAO1菌株100 μL接种于新鲜LB培养液5 mL，37 ℃震荡培养过夜；将菌液涂布于LB平板上，37 ℃孵育约20 h，挑单克隆接种于新鲜LB培养液，37 ℃震荡培养过夜，然后用新鲜LB培养液洗涤、悬浮至A600为0.05，继续培养至对数生长期，用新鲜LB培养液稀释至A600为0.05。在96孔PVC板中完成各组配液，于各组中分别加入细菌悬液95 μL，使CIP、LFchimera及CIP+LFchimera达到所需终浓度。37 ℃孵育24 h。每孔无菌纯化水200 μL洗涤3次去除浮游细菌，静置风干后，每孔加入0.1%结晶紫150 μL在室温静置15 min，然后用无菌纯水漂洗3次去除剩余结晶紫。再每孔加入95%乙醇200 μL洗脱生物膜上的结晶紫，静置15 min。最后酶标仪检测A590。

1.4.2 QS系统信号分子检测 E.coli MG-4自身不能产生AHL分子，也不能合成β-半乳糖苷酶(lacZ)。质粒pKDT17含有一个lasR lasB'-lacZ报告基因系统，lasR是铜绿假单胞菌密度感知系统的顺式调控元件，只有当AHL信号分子与lasR结合后才能启动lasB'-lacZ基因的表达[7-9]。因此AHL检测菌株E.coli MG-4(含有质粒pKDT17)菌体内β-半乳糖苷酶活性高低由外界AHL调控，能够反应所在环境中的AHL水平。β-半乳糖苷酶活性检测采用邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ortho-nitrophenol beta-D-galactose glucoside,ONPG)法：β-半乳糖苷酶能将无色的ONPG水解为黄色的邻位硝基苯酚(orho-nitrophenol,ONP)，然后通过分光光度计检测产物ONP。操作步骤如下：挑取MG4单克隆37 ℃ 、200 r·min-1振摇12 h，稀释至A600为0.1的细菌悬液；取-80 ℃冻存PAO1菌株100 μL接种于新鲜LB培养液5 mL，37 ℃震荡培养过夜，将菌液涂布于LB平板上，37 ℃孵育约20 h，挑单克隆接种于新鲜LB培养液，37 ℃震荡培养过夜，然后用新鲜LB培养液洗涤、悬浮至A600为0.05；于各组中分别加入铜绿假单胞菌细菌悬液5 mL，使CIP、LFchimera及CIP+LFchimera达到所需终浓度，37 ℃恒温培养箱200 r·min-1振荡孵育24 h；1%(体积比)乙酸酸化的乙酸乙酯5 mL从各组铜绿假单胞菌过夜培养物10 mL中萃取AHL信号分子，分装于离心管中干燥；在各组离心管中加入反应缓冲液100 μL，反应1min后加入LB培养液800 μL，加入MG4细菌悬液100 μL，30 ℃、200 r·min-1振摇5.5 h；12 000 r·min-1离心2 min后收集细菌，加入细菌裂解液裂解细菌，12 000 r·min-1离心10 min收集上清液；在总体积为1 mL的柠檬酸反应缓冲液(0.1 mol·L-1柠檬酸用氢氧化钠调至pH 4.5)中含0.8 μmol·L-1的ONPG，37 ℃孵育30 min后，用0.5 mol·L-1冷碳酸钠1 mL终止反应，用紫外分光光度计于420 nm波长处测定ONP的A值。

2 结果

生物膜定量表达及QS系统信号分子表达情况见表1。与对照组比较，CIP组、0.25 μmol·L-1LFchimera组、1.00 μmol·L-1LFchimera组、CIP+ LFchimera组的PAO1生物膜定量表达及QS系统信号分子表达均下降，差异有统计学意义(均P<0.05)。CIP组和0.25 μmol·L-1LFchimera组比较，PAO1生物膜的定量表达和QS系统信号分子表达的差异无统计学意义(P>0.05)。1.00 μmol·L-1LFchimera 组的PAO1生物膜定量表达及QS系统信号分子表达较0.25 μmol·L-1LFchimera组和CIP组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。 CIP+LFchimera组和单独用药组比较，PAO1生物膜的定量表达及QS系统信号分子表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 5组铜绿假单胞菌的生物膜定量和QS系统信号分子的表达

与对照组比较，*1P<0.05；与1.00 μmol·L-1LFchimera组比较，*2P<0.05；与CIP+ LFchimera组比较，*3P<0.05

Compared with control group，*1P<0.05；Compared with 1.00 μmol·L-1LFchimera group，*2P<0.05；Compared with CIP plus LFchimera group，*3P<0.05

3 讨论

近年来人们对抗菌药物的过分依赖和滥用，使得很多细菌对抗菌药的敏感性不断降低甚至消失，导致相关感染性疾病的临床治疗越来越棘手。铜绿假单胞菌是常见条件致病菌，多见于慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张等慢性肺部感染，是常见的医院获得性感染病原菌。生物膜的生成、多种毒力因子的产生是铜绿假单胞菌感染难治性的主要原因。由于生物膜可以保护细菌抵御抗菌药物的杀伤和逃逸宿主的免疫，同时膜内的细菌在适宜的条件下又可以从膜内扩散、游离，引起机体的再次感染，给临床治疗带来困难[10]。生物膜菌是一个群体组织，它由很多微菌落组成，并且各个细胞间有着严密的信号传导来交流信息。铜绿假单胞菌主要依赖AHL作为信号分子。QS有两种主要信号系统：las系统和rhl系统。其中lasI和rhlI编码AHL合成酶，进而催化AHL的合成[11]。QS系统调节细菌群体的许多生理功能，如游动能力、颤搐运动、质粒转移、生物膜形成、毒力因子产生等[12]。因此，QS系统已成为控制生物膜相关性感染的新靶点。

CIP具有良好的药动学特点和强大的杀铜绿假单胞菌活性，多年来一直是临床上常用的抗铜绿假单胞菌药物。研究表明，亚抑菌浓度的抗菌药物对细菌可能有多方面的作用，并且完全不同于高浓度的抗菌药物，如亚抑菌浓度的环丙沙星、头孢他啶、阿奇霉素均能降低由铜绿假单胞菌QS系统调控的毒力因子的表达[13]。抗菌肽是一类具有广泛的抗微生物作用的多肽，被称之为 “自然抗菌药物”。 乳铁蛋白多肽(lactoferrin-derived peptides)是乳铁蛋白(lactoferrin，LF)经胃蛋白酶水解产生的分子片段，具有比母分子LF更强的杀菌活性[14-16]。LF通过与铁结合，抑制细菌生物膜形成，破坏细胞膜稳定性，降解细菌毒力蛋白，防止致病菌入侵等多种方式发挥其广谱抗菌作用[17]。Lactoferricin(LFcin)和Lactoferrampin(LFampin)是从牛乳铁蛋白N端区域获得的，具有抗多种革兰阳性和革兰阴性细菌活性的抗菌肽[16，18-19]。研究发现，用赖氨酸将LFcin和LFampin连接生成的新分子LFchimera具有比构成它的多肽LFcin和LFampin以及牛乳铁蛋白更强的杀菌活性[20-21]。笔者之前的研究也发现LF、LFcin、LFampin和LFchimera可以抑制生物膜的形成，尤其是LFchimera的作用更明显[4]。LFchimera还可能通过抑制铜绿假单胞菌QS系统减弱其毒力因子(绿脓菌素、弹性蛋白酶和蛋白水解酶)的表达[22]。而CIP和LFchimera联用在抗铜绿假单胞菌毒力因子方面有协同作用[23]。

本次研究将亚抑菌浓度的CIP和LFchimera联合作用于铜绿假单胞菌，观察其对PAO1生物膜形成及QS系统信号分子生成的影响。结果显示亚抑菌浓度(0.04 μg·mL-1)CIP、LFchimera都能抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成。随着浓度的提高，LFchimera对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用增强。亚抑菌浓度CIP对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用与低浓度LFchimera(0.25 μmol·L-1)相当，但弱于较高浓度LFchimera(1.00 μmol·L-1)。CIP联合LFchimera(1.00 μmol·L-1)组的生物膜定量表达较各自单独用药时有明显降低，提示两者联用能增强对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用，说明两者在抗铜绿假单胞菌生物膜形成方面有协同作用。由于铜绿假单胞菌生物膜的形成受QS系统调节，因此CIP、LFchimera及两者联用对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用有可能是通过影响QS系统来实现的。本研究结果也证实了CIP、LFchimera及两者联用能抑制铜绿假单胞菌QS系统信号分子的生成，且随着浓度的提高，LFchimera对铜绿假单胞菌QS系统信号分子生成的抑制作用增强，而CIP与LFchimera联用的抑制作用更明显。这为临床上联合运用抗菌药物和抗菌肽治疗铜绿假单胞菌感染提供了实验依据。

综上所述，LFchimera、CIP能抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成，LFchimera对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用随着浓度的提高而增强，CIP与LFchimera联用能增强对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用，提示两者有协同作用。并且这种作用可能是通过抑制QS系统信号分子的生成来实现的。为进一步明确其机制，笔者将继续深入研究CIP与LFchimera联用后铜绿假单胞菌QS系统相关基因的表达情况，为临床用药提供更明确的证据。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.008

Inhibitory Effect of Ciprofloxacin Combined with Lactoferrin-derived Peptides Chimera on the Biofilm Formation and Production of the Signal Molecules of Quorum Sensing System inPseudomonasaeruginosa

ZUO Peng, WANG Aili，WANG Zhengyun，XU Guopeng, HU Qiongjie, SHAO Bing, XU Xilin, XIONG Weining，XIONG Shengdao

(DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030 ,China)

Objective To compare the inhibitory effect of single use of ciprofloxacin (CIP)，lactoferrin-derived peptides chimera (LFchimera) and combination of CIP plus LFchimera on the biofilm formation and production of the signal molecules of quorum sensing(QS) system inPseudomonasaeruginosa. Methods The wild type strain ofP.aeruginosa-PAO1 was used as test strain,which was divided into the control group , CIP(0.04 μg·mL-1)group, LFchimera(0.25 μmol·L-1and 1.00 μmol·L-1), CIP(0.04 μg·mL-1) plus LFchimera(1.00 μmol·L-1)one.The expression of biofilm and the signal molecules of QS in PAO1 were quantitatively determined respectively, and were compared among groups. Results Compared with those in the control group(1.511 3±0.031 8，0.502 5±0.028 3), the quantitative expression of biofilm and the signal molecules of QS in CIP group(1.073 3±0.010 9，0.245 3±0.014 0),LFchimera low dose group(1.065 5±0.011 4，0.235 9±0.010 7),LFchimera high dose group(0.665 3±0.012 9，0.108 6±0.007 0)and the combination group(0.122 1±0.013 0，0.048 2±0.005 4)were all significantly reduced (P<0.05).The quantitative expression of biofilm and the signal molecules of QS had no significant differences between the CIP group and LFchimera low dose group(P>0.05), were significantly lower in the LFchimera high does group compared to the LFchimera low dose group and the CIP group(P<0.05), and were remarkably lower in the combination group compared to single drug groups (P<0.05). Conclusion Both of CIP and LFchimera at sub-MICs could inhibit biofilm formation and the production of signal molecules of QS inPseudomonasaeruginosa.The inhibition effect of LFchimera is dose-dependent.This inhibitory effect could be further enhanced when CIP is combined with LFchimera, which indicats they have synergistic effect on the resistance of biofilm formation inPseudomonasaeruginosaby suppressing the production of the signal molecules of QS.

Ciprofloxacin；Lactoferrin；Pseudomonasaeruginosa；Biofilm；Quorum sensing system

2014-06-16

2014-08-08

*国家自然科学基金资助项目(30770946)；中国呼吸道感染优化治疗协作组(CROTC)科研专项基金资助项目(2009042)；国家“十二五”支撑课题(2012BAI05B01)

左鹏(1977-)，男，湖北武汉人，副主任医师，硕士，从事呼吸道感染性疾病的研究。电话：027-83663615，E-mail：zuopeng1123@163.com。

熊盛道(1946-)，女，主任医师 教授，博士生导师，主要从事呼吸系统疾病的临床、科研、教学工作。电话：027-83662898，E-mail：xiongshengdao@sina.com。

R969；R965

A

1004-0781(2015)01-0035-05