犬细小病毒宁夏株的分离与鉴定

杨 丽，段相国，刘宏鹏，徐广贤，郭文伟，张议心，赵 瑾

（宁夏医科大学检验学院 宁夏临床病原微生物重点实验室，宁夏 银川 750004）

犬细小病毒宁夏株的分离与鉴定

杨 丽，段相国，刘宏鹏，徐广贤，郭文伟，张议心，赵 瑾

（宁夏医科大学检验学院 宁夏临床病原微生物重点实验室，宁夏 银川 750004）

本试验采集宁夏地区疑似犬细小病毒感染病犬的粪便拭子，经过预处理后同步接种胎猫肾细胞（FK81），盲传3代后发现FK81细胞出现明显的细胞毒性改变（CPE）。冻融收获病毒后，对分离出来的病毒进行电镜观察、间接免疫荧光试验（IFA）检测、特异性PCR鉴定及VP2全基因序列扩增分析，成功分离培养出1株犬细小病毒（CPV）。

犬细小病毒；分离鉴定；FK81；VP2基因

犬细小病毒（CPV）属于细小病毒科，细小病毒属，为无囊膜自主复制的单股负链线性DNA病毒。CPV会引起犬细小病毒病（CP），又名犬出血性肠炎，是一种急性烈性传染病，发病率高，传染性强，死亡率高，是危害中国养犬业最为严重的传染病之一。1979年Appel[1]等首次从患出血性肠炎病犬中成功分离出CPV，即CPV-2型。本文主要针对CPV的VP2基因设计引物来鉴别诊断分离出来的CPV毒株，旨在为后期的CPV单克隆抗体疫苗的研制和分子生物学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病料 2014年5月中旬采集宁夏某宠物医院1只有发热、厌食、频繁呕吐、剧烈腹泻症状病犬的粪便拭子。将粪便拭子迅速放入每支含有2.5 mL PBS的离心管中，-80℃冻存。PBS含有100 U/mL的双抗溶液。

1.2 细胞系、抗体 胎猫肾细胞系（FK81）由本实验室保存，CPV阳性鼠抗血清由实验室自己制备。

1.3 主要试剂 胎牛血清、DMEM培养液，均购自GIBICO公司；青霉素链霉素混合液、EDTA-胰蛋白酶消化液，购自北京索莱宝科技有限公司；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP，购自天根生化科技（北京）有限公司，DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒，购自Omea公司；T载体，购自北京全式金生物技术有限公司，羊抗鼠FTIC-IgG荧光抗体，购自Proteintech公司。

1.4 病料的处理 在接毒前将病料反复冻融3次，

用无菌镊子将粪便拭子上液体挤干。4℃10 000 r/min离心30min后，吸取上清用0.22μm无菌滤器过滤后，分装到无菌EP管中，作为待分离病毒样品，并冻存于-80℃备用。

1.5 病毒的分离培养 采用同步接毒法，将长成单层的FK81细胞消化传代的同时，加入500μL待分离病毒样品,即按培养液量体积的1/10接毒。置于37℃、5%CO2培养箱培养24 h后，换维持培养液继续培养，并设立未接毒的空白对照。培养期间每天观察细胞毒性病变（CPE）。接毒3～4 d后，将培养物反复冻融3次，12 000 r/min（4℃）离心后，取上清继续接毒培养，待FK81出现90%以上CPE时收毒，-80℃冻存备用。

1.6 病毒基因组提取 按照OMEGA DNA提取试剂盒说明书分别提取第3代收获病毒液DNA和空白对照组FK81细胞的DNA。

1.7 特异性基因和VP2基因全序列的扩增 PCR鉴定引物1参照文献[2]合成；VP2基因全序列扩增引物2根据Gene Bank上发表的CPV VP2基因序列利用Primer5.0设计合成。两对引物都在北京三博远志生物科技有限责任公司合成。引物序列如表1所示。

表1 寡居核苷酸引物

PCR反应体系（50μL）：10×Buffer 5μL，dNTP4 μL，上游引物1μL，下游引物1μL，Taq DNA聚合酶1μL，模板2μL，ddH2O 36μL。209 bp片段PCR反应条件：94℃5min；94℃30 s，55℃30 s，72℃

30 s，35个循环；72℃延伸8min。1 755 bp片段PCR反应条件：96℃4min；96℃1min，52℃1min，72℃2min，30个循环；72℃延伸8min。反应结束后取10 μL电泳检测结果。

用OMEGA胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，与T载体连接转化后，送北京生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.8 电镜拍摄病毒粒子取收获的第3代病毒液，滴1滴于铜网上晾干后，再滴一滴2%磷钨酸负染，电镜下观察病毒粒子形态和大小。

1.9 间接免疫荧光（IFA）试验 在96孔板接种1× 104细胞，并同步接毒1/10体积病毒液，培养72 h后，弃去上清，用PBS洗3遍，用预冷（-20℃）甲醇固定20min，待自然风干后，加入一抗100μL，37℃孵育1 h，PBS洗涤3遍，加FTIC标记的二抗100μL，37℃孵育1 h，PBS洗涤后，在倒置荧光显微镜下观察结果并拍照。同时设立阴性对照。

2 结果

2.1 病毒分离培养结果 处理过的病料同步接毒于FK81细胞后盲传至第3代，与接毒前FK81细胞相比，90%以上细胞发生形态改变，出现明显的CPE。试验结果记录了接毒前、接毒24 h、接毒48 h、接毒72 h FK81细胞的形态变化，见图1。

图1 FK81细胞接种CPV后的细胞病变A：接毒前FK81细胞；B：接种CPV 24 h后FK81细胞CPE；C：接种CPV 48 h后FK81细胞CPE；D：接种CPV 72 h后FK81细胞CPE

2.2 电镜鉴定结果 电镜负染可观察到第3代病毒收获液中呈现立体对称、圆形、无囊膜，直径在20～25 nm之间的实心病毒粒子，如图2所示。

2.3 特异性基因和VP2全基因的PCR扩增结果

图2 CPV病毒粒子负染照片

提取第3代病毒液的病毒基因组DNA和未接毒的FK81细胞的基因组DNA（阴性对照），PCR扩增后，扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，在209 bp、1 755 bp处出现与预计大小一致的目的片段，见图3、图4。

2.4 间接免疫荧光试验（IFA）检测结果 CPV感染FK81细胞72 h后，IFA试验结果表明，病毒在FK81细胞质中复制，并且集中在细胞核周围。如图5所示，特异性绿色荧光主要集中在细胞核周围。阴性对照组无特异性绿色荧光出现。

3 讨论

CP是危害犬类的最主要的烈性传染病之一，给养犬业和宠物爱好者带来了严重的危害和精神损失。且随着CPV病毒的不断变异，市场上的疫苗保护力逐渐减弱或者失去保护力，这使得对CPV的研究和新型疫苗的制备更加迫在眉睫。

图3 特异性检测扩增结果 （209 bp）M：DL-2 000Marker；1、2：第3代病毒液扩增产物；3：阴性对照

图4 VP2全基因扩增结果 （1 755 bp）M：DL-2 000Marker；1：第3代病毒液扩增产物；2：阴性对照

图5 间接免疫荧光检测CPV在FK81细胞中复制A：接种CPV的FK81细胞；B：A的局部放大图

本试验采集宁夏地区某宠物医院疑似CPV感染的病犬粪便拭子，对病料进行处理后，同步接毒FK81细胞后，第1代细胞形态无任何改变，盲传至第2代少数细胞发生形态学改变，盲传至第3代后90%以上细胞出现CPE，此时收毒-80℃冻存备用。试验选择CPV病毒易感的FK81细胞作为分离病毒的细胞系，使得病毒分离成功的几率提高，且病毒产生的CPE病变容易观察判断。选择同步接毒的原因是CPV病毒完全依赖宿主细胞DNA的复制机制进行复制,复制主要在细胞周期的S期晚期和G2早期。

将分离的第3代病毒液用2%磷钨酸负染后，电镜观察可以看到圆形、无囊膜，直径在20～23 nm之间的CPV病毒粒子。电镜观察是从形态学方面对CPV进行直观、准确的鉴定，操作方法简便，省时省力，是CPV病毒常用的诊断方法之一。

提取第3代病毒液DNA,进行PCR特性鉴定和VP2基因全长扩增，均得到了与预期大小一致的目的片段，且测序结果与CPV基因序列比对后高度相符，更加证明了病毒鉴定的准确性。PCR鉴定方法和实验室其他常规鉴定方法相比，PCR鉴定更为精确，可以排除其他同属病毒的干扰，增强了鉴定的特异性、准确性。

病毒同步接种单层FK81细胞72h后，用间接免疫荧光试验检测CPV病毒在FK81细胞中的复制情况，发现特异性绿色荧光主要集中在FK81细胞核周围。此法简便、快速、检出率较高，许多国家和地区已将该法作为CPV的法定诊断方法，也是我国实验室诊断CPV最常用的定性方法之一[3]。

本试验用实验室常用的CPV诊断方法进行分离鉴定，成功分离鉴定出1株CPV毒株，为以后CPV新疫苗的研究即单克隆抗体的制备奠定了基础，丰富了流行病学资料，也为本实验室进行CPV单克隆抗体新型诊断试剂盒的研究奠定了基础。

[1]Appel，M JG，Scott FW，et al.Isolation and immunization stud⁃ies of a canine parvo-like virus from dogswith hemorrhagic enter⁃itis[J].VetRec，1979，105：156-159.

[2]祝文琪，徐卫康，陆彦，等.犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立[J].动物医学进展，2013，34（5）：17-20.

[3]徐钰，刘剑郁，解林红，等.犬细小病毒诊断与防制研究进展[J].四川动物，2013，32（3）：475-479.

S852.65

A

0529-6005（2015）11-0055-03

2015-06-16

杨丽（1990-），女，硕士生，主要从事临床病原微生物与免疫学检验方面研究，E-mail：125389191@qq.com

徐广贤，E-mail：xgx205079@sina.com