中心复合设计法优化制备丹参酮ⅡA鱼精蛋白纳米粒

冯 博， 承 伟

（辽宁医学院药学院，辽宁锦州121000）

中心复合设计法优化制备丹参酮ⅡA鱼精蛋白纳米粒

冯 博， 承 伟*

（辽宁医学院药学院，辽宁锦州121000）

目的 采用中心复合设计法优化制备丹参酮ⅡA鱼精蛋白纳米粒。方法 以鱼精蛋白为载体材料，应用去溶剂法制备丹参酮ⅡA鱼精蛋白纳米粒。再以丹参酮ⅡA与鱼精蛋白比例、药物在乙醇中质量浓度、乙醇与水体积比为考察因素，以包封率为考察指标，根据中心复合设计原理安排实验，筛选最佳工艺，并对所得纳米粒进行形态、粒径及释放度等体外表征。结果 最优工艺条件为丹参酮ⅡA与鱼精蛋白比例 （m/m）0.25，药物在乙醇中质量浓度10 mg/m L，乙醇与水体积比1：1。在此条件下，纳米粒包封率为86.05%，模型预测值和实测值接近。所得纳米粒外观呈球形，平均粒径为 （112.3±20.4）nm，体外释放行为呈良好的缓释特性。结论 该工艺条件准确可靠，具有实用价值，所建立模型的预测性良好。

丹参酮ⅡA；鱼精蛋白；纳米粒；中心复合设计法

中心复合设计（central composite design，CCD）是近年来国外常采用的实验优化方法，具有试验次数少、精度高等特点，相较于国内普遍应用的正交设计和均匀设计，该设计在试验安排及结果预测上更接近真实值，因而在处方设计和工艺筛选中的优势更为显著［1］。丹参酮，亦称总丹参酮，是从中药丹参Salviamiltiorrhiza Bunge根部提取出的具有抑菌作用的脂溶性化合物，包括丹参酮I、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮、异隐丹参酮等多个单体，其中丹参酮ⅡA为主要的脂溶性成分。研究表明，丹参酮ⅡA能有效改善冠状动脉循环及微循环障碍，促进心肌再生，抑制细胞损伤等，同时还具有抗感染、抗氧化、抗肿瘤、改善肝功能、改善微循环等药理作用，其抗肿瘤活性，尤其在胃部肿瘤等临床治疗上的疗效确切［2-4］。研究表明，丹参酮ⅡA能降低RNAPⅡ的蛋白水平，同时激活P53，诱导细胞凋亡，依赖于这种DNA分子构象损伤的RNAP II响应是决定丹参酮IIA发挥抗肿瘤活性的分子基础［5］，因此可认为它是一种极有应用前景的抗肿瘤药物。但是，由于丹参酮ⅡA水溶性较差，口服生物利用度较低，体内消除半衰期短，临床上常采用其磺酸钠盐注射液，但它稳定性较差，刺激性较强，临床表现复杂，主要为皮肤及其附件损害、全身性反应，严重者可出现过敏性休克［6］。本实验针对丹参酮ⅡA的理化性质，采用去溶剂化交联法制备丹参酮ⅡA鱼精

蛋白纳米粒，然后应用中心复合设计法对其优化制备，并进行形态、粒径及释放度等体外表征，以期降低药物刺激性，提高制剂稳定性，并最终达到提高丹参酮ⅡA体内生物利用度及滞留时间的目的，进而提高其抗肿瘤效果。

1 仪器与试药

1.1 仪器 RC-6溶出度测试仪 （天津市新天光仪器分析技术有限公司）；UV-2450紫外可见分光光度计 （日本岛津公司）；KQ-300E型超声波清洗器 （上海生析超声仪器有限公司）；JEM-1200EX透射电子显微镜 （日本电子株式会社）；Nano ZS90粒度电位分析仪（英国Malvern公司）。

1.2 试药 FractionV鱼精蛋白（美国Sigma公司）；丹参酮ⅡA对照品 （中国食品药品检定研究院，编号110766-200918，纯度＞98%）；丹参酮ⅡA（批号20090723，陕西昂盛生物医药科技有限公司，质量分数＞95%）。所用试剂均为分析纯 （国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 丹参酮ⅡA鱼精蛋白纳米粒的制备 称取鱼精蛋白适量，分散于去离子水中，涡旋震荡至全部溶解，形成溶液（A），将丹参酮ⅡA溶解于适量乙醇中，形成溶液 （B）。然后，在一定转速的搅拌下将溶液 （B）缓慢滴至溶液（A）中至有乳光产生，形成初始纳米粒，旋转蒸发浓缩除去乙醇，出现有明显乳光的分散体系，即得。

2.2 检测波长的确立及方法学试验

2.2.1 检测波长的选择 精密称取丹参酮ⅡA对照品适量，加乙醇溶解，定容至50 mL，作为对照品溶液。然后，分别将对照品和辅料溶液稀释至一定质量浓度后，在波长200～400 nm范围内扫描。结果显示，丹参酮ⅡA在270 nm处有最大吸收，而且辅料在此波长下无干扰，故选择270 nm作为检测波长。

2.2.2 方法学试验 精密吸取对照品贮备液适量，配制成质量浓度分别为3.0、6.0、9.0、12.0、15.0、21.0、30.0 μg/m L的对照品溶液。以270 nm波长处的吸光度 （A）为纵坐标 （Y），药物质量浓度 （μg/mL，G）为横坐标 （X）进行线性回归，得到标准回归方程Y=0.013 7X+0.148（r=0.999 7，n=6），表明丹参酮ⅡA在3.0～30.0μg/mL范围内线性关系良好。然后，精密量取6.0、12.0和24.0 μg/m L三个质量浓度的丹参酮ⅡA对照品溶液，进行精密度实验，各质量浓度样品连续测定5次，测得RSD分别为0.018%、0.007%和0.011%。另取空白纳米粒溶液适量，进行加样回收试验，测得平均回收率为99.26%，RSD为0.016%，符合体外分析方法要求。

2.3 包封率测定［7-9］精密称取丹参酮ⅡA鱼精蛋白纳米粒适量，分散于10 mL乙醇溶液中，在20 000 r/min下冷冻离心30min，取上清液5 mL，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液于270 nm波长处测定吸光度，根据回归方程计算上清液中丹参酮ⅡA（即体系中游离药物）的含有量，再按下式计算纳米粒包封率（encapsulation efficiency，EE），公式为EE=［（W0-W1）/W0］×100%。其中，W0为原始投药量 （mg），W1为体系中游离药物量 （mg）。

2.4 响应面分析方案及试验结果

2.4.1 模型建立与分析 在预试验基础上，最终选择影响纳米粒形成的三个主要影响因素，即丹参酮ⅡA与鱼精蛋白质量比 （X1）、药物在乙醇中质量浓度 （g/mL，X2），乙醇与水体积比 （X3），以包封率 （Y）为考察指标，中心复合设计法安排试验，方案及结果见表1、表2。

表1 因素水平表

表2 中心复合设计试验与结果

根据试验结果，利用Design-Expert软件对数据进行回归分析及参数估计，得到二次多元回归方程Y=-2.497+ 207.504X1+4.933X2+99.055X3-3.472X1X2-11.469X1X3-（r=0.948 0，P=0.000 7），方差分析结果见表3。由表可知，三个因素对鱼精蛋白纳米粒的包封率均有显著性影响，而且药物在乙醇中质量浓度 （g/mL，X2）与乙醇与水体积比 （X3）的交互作用对纳米粒的包封率影响也较大。

表3 方差分析

由回归模型处理得到的三因素交互作用对纳米粒包封率影响的三维曲面图见，图1。由图可知，三种因素交互影响丹参酮ⅡA鱼精蛋白纳米粒的包封率，其中丹参酮ⅡA与鱼精蛋白质量比 （X1）越大，药物在纳米粒中的包封率越小，但当X1极小时，药物的包封率也随之下降，纳米粒的包封率受药物在乙醇中质量浓度 （g/mL，X2）和乙醇与水体积比 （X3）的交互影响较为显著，并且存在最优区间。

图1 纳米粒包封率与影响因素X1、X2和X3三维效应面关系图

2.4.2 模型预测与验证 相同条件下，药物包封率越高，说明制备过程中对药物的利用率越大。由回归方程处理得到的响应面可知，最优区域为曲面向心处。综合考虑试验操作的可行性，从该区域中预测纳米粒制备的最佳处方工艺为丹参酮ⅡA与鱼精蛋白质量比0.25，药物在乙醇中质量浓度10 mg/mL、乙醇与水体积比1：1，模型预测包封率85.58%。采用上述条件制备丹参酮ⅡA鱼精蛋白纳米粒三批，测得药物包封率分别为86.02%、85.74%、86.38%，平均包封率为86.05%，与预测值 （85.58%）接近。

2.5 纳米粒的粒径及形态表征分析 应用粒度电位分析仪对最优工艺下制备的丹参酮ⅡA鱼精蛋白纳米粒进行粒径、Zeta电位的测定，在覆有支持膜的铜网上滴加纳米粒溶液2～3滴，干燥10min，透射电子显微镜观察纳米粒的形态和大小，结果见图2。由图可知，丹参酮ⅡA鱼精蛋白纳米粒外观为球状，粒径为 （112.3±20.4）nm，多分散指数为0.023，Zeta电位为+（15±1.9）mV。

图2 丹参酮ⅡA鱼精蛋白纳米粒的粒径分布和透射电镜图

2.6 释放度的测定 采用恒温透析法测定药物在磷酸盐缓冲溶液 （pH为7.4）中的释放度。分别精密称取冷冻干燥的丹参酮IIA鱼精蛋白纳米粒和丹参酮IIA对照品适量，置于透析袋中，紧密封口，加到200 mL磷酸盐缓冲液 （pH为7.4）中，（37±0.5）℃下水浴加热，转速为50 r/min。然后，在预设时间点取液2.5 mL，并立即补加等量同温的释放介质，0.45μm微孔滤膜过滤，续滤液稀释2倍，于270 nm波长处测定紫外吸光度，按标准曲线法计算丹参酮IIA含有量，计算纳米粒和药物混悬液在不同时间的累积释放百分率，结果见图3。由图可知，与丹参酮ⅡA混悬液相比，纳米粒具有更好的缓释作用，并且无明显突释效应。

图3 丹参酮ⅡA鱼精蛋白纳米粒在磷酸盐缓冲溶液（pH为7.4）中的释放度（n=3）

3 讨论

鱼精蛋白是一种碱性蛋白质，主要在鱼类成熟精子细胞核中作为和DNA结合的核精蛋白存在。研究报道，它可作为细胞穿膜肽携带比其分子量大的外源性疏水物质，以能量依赖性的方式进入细胞，并且无明显细胞毒作用，因此可用于肿瘤药物纳米粒的载体材料或表面修饰［10］。本实验设计了丹参酮ⅡA鱼精蛋白纳米粒，制备条件温和、操作简单，以期通过鱼精蛋白的透膜作用来开发出一种适用于肿瘤治疗的有应用前景的纳米药物传递系统。

体外释放试验表明，在制备和干燥过程中，部分药物可能吸附在纳米粒表面，当与释放介质接触时，药物迅速进入介质中，造成初始释放曲线的突释现象。随着时间延长，鱼精蛋白被不断溶蚀，药物通过扩散，从纳米粒内部逐渐释放，从而维持其缓慢长期释放，而药物粉末因不具有类似保护载体，致使药物突释现象明显。

中心复合设计法利用多项式，近似地把交互因素与试验结果的关系函数化，从而得到整个区域上因素的最佳组合和最优响应值［11-13］。选择的三种影响因素为丹参酮ⅡA与鱼精蛋白质量比 （X1）、药物在乙醇中质量浓度 （g/mL，X2）、乙醇与水体积比 （X3），均是在单因素考察的基础上所确立的，其影响水平主要取决于制备过程中体系药物的浓度、药物的成核速度以及载体鱼精蛋白的包裹能力，由于影响因素X1和X3直接决定药物的终浓度和终体积，所以具有更显著的影响意义。本实验中较优处方的实测值与模型预测值接近，说明该试验因素选择的中心点符合试验设计要求，所选取的因素为影响纳米粒制剂的主要因素，尽管失拟项具有显著性差异，模型拟合效果稍差，但模型中各因素的影响均较显著，而影响水平不显著，考虑到该优化水平是基于单因素考察的结果而设定的，综合分析各影响因素，其结果基本可信［14-15］。综上所述，三种因素对纳米粒的包封率均有显著影响，并且具有交互作用，说明在处方和工艺筛选上应用中心复合设计法具有良好的应用价值。

［1］ Wu W，Cui G H.Central composite design and response surfacemethod and its application in pharmacy［J］.Forneign Med Sci（Sect Pharm），2000，27（5）：292-298.

［2］ 李玉萍，顾 兵，刘建涛，等.丹参酮ⅡA的研究进展［J］.时珍国医国药，2010，21（7）：1770-1772.

［3］ 杨 琼，叶再元，叶 平.丹参酮ⅡA对人胃癌MKN-45细胞增殖及基质金属蛋白酶-2表达的影响［J］.浙江中医药大学学报，2009，33（3）：311-315.

［4］ 赵雪峰，贾 楠，李 勇，等.丹参酮ⅡA对胃癌细胞迁移和侵袭能力的抑制作用及机制［J］.中国癌症杂志，2013，23（10）：793-797.

［5］ 高 金.丹参酮ⅡA抗肿瘤分子机理的研究［D］.大连：大连理工大学，2010.

［6］ 孔飞飞，谭兴起，郭良君，等.丹参酮ⅡA磺酸钠注射液不良反应文献分析［J］.中国药房，2011，22（35）：3339-3341.

［7］ 张晓燕，平其能.多西紫杉醇白蛋白纳米粒的制备及体外评价［J］.药学进展，2008，32（5）：223-228.

［8］ 穆云龙，余旭亚，孟庆雄，等.鱼精蛋白的研究与开发［J］.食品与药品，2006，8（9A）：11-13.

［9］ 田新华，林晓宁，魏 峰，等.替莫唑胺聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的制备［J］.中国医院药学杂志，2011，31（20）：1689-1693.

［10］ 韩瑞玲.鱼精蛋白包覆PLGA纳米粒用于疫苗载体的初步研究［D］.武汉：华中科技大学，2010.

［11］ 欧阳辉，田启建，余 佶，等.酶法辅助提取绞股蓝中总黄酮工艺优化［J］.中草药，2011，42（5）：886-889.

［12］ 李春英，李晓娟，杨 磊，等.响应面分析法优化甘草酸和甘草黄酮联合提取工艺［J］.黑龙江大学自然科学学报，2009，26（3）：390-395.

［13］ 刘艳杰，项荣武.星点设计效应面法在药学试验设计中的应用［J］.中国现代应用药学，2007，24（6）：455-457.

［14］ 李 磊，陈大为，赵秀丽，等.采用星点设计-效应面法优化及制备阿霉素白蛋白纳米粒［J］.沈阳药科大学学报，2011，28（5）：350-354.

［15］ Zhao L，Zhu B，Jia Y，et al.Preparation of biocompatible carboxymethyl chitosan nanoparticles for delivery of antibiotic drug［J］.Biomed Res Int，2013，2013：1-7.

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1001-1528（2015）11-2534-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.046

2015-02-11

冯 博（1989—），女，硕士，从事中西药物新型给药系统研究。Tel：13940536239，E-mail：lyyxfengbo@163.com

*通信作者：承 伟 （1958—），男，博士，教授，从事中西药物新型给药系统研究。Tel：13019810828，E-mail：cheng2553807@ 126.com