刺头复叶耳蕨总黄酮体内抗肿瘤作用初探

李辉敏， 殷嫦嫦， 姜登钊

（1.九江学院基础医学院，江西九江332000；2.九江学院药学与生命科学学院，江西九江332000）

刺头复叶耳蕨总黄酮体内抗肿瘤作用初探

李辉敏1， 殷嫦嫦1， 姜登钊2

（1.九江学院基础医学院，江西九江332000；2.九江学院药学与生命科学学院，江西九江332000）

目的 研究刺头复叶耳蕨（Arachniodes exilis Ching）总黄酮的体内抗肿瘤活性。方法 应用HepG2细胞裸小鼠异位移植瘤模型，通过测定抑瘤率及检测相关生化指标、HE染色、免疫组化等方法了解其抗肿瘤作用及作用机制。结果 刺头复叶耳蕨总黄酮能够抑制肝癌异位移植瘤模型动物体内肿瘤生长，对实验动物的体质量、血液系统无明显影响，肿瘤组织中促凋亡蛋白Bax表达水平明显升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平明显下调。结论 体内抗肿瘤活性的研究显示刺头复叶耳蕨总黄酮抗肿瘤作用可能与其诱导肿瘤细胞凋亡有关。

刺头复叶耳蕨；总黄酮；裸小鼠；HepG2细胞；增殖

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，而我国是肝癌的高发地区，每年全球新发肝癌病例中我国占45%［1］。目前临床肝癌诊疗中还存在着早期诊断难、复发转移率高和治疗手段少等问题［2］。因此，寻找和发掘新的肝癌治疗药物显得尤为重要和迫切。近年来，多倾向于采用综合措施治疗肝癌，其中中医药是非常重要的一部分。中医药在抗癌方面展现出独到的优势，因其抗肿瘤作用温和，能增强机体免疫功能，缓解症状，减少治疗的不良反应等作用而受到了众多学者的研究和关注［3］。

刺头复叶耳蕨（Arachniodes exilis Ching）为鳞毛蕨科复叶耳蕨属植物，广泛分布于世界热带和亚热带湿润区域，以亚洲东部和东南部种类最为丰富，我国主要分布于长江流域以南地区及山东、河南等省，具有清热利湿，抗菌消炎，镇静作用，民间用于治疗急性黄疸型肝炎、关节炎、痢疾、烫火伤等［4］。有研究表明鳞毛蕨类植物有包括抗病毒、

抗肿瘤等药理作用，产生这些药理作用的成分是黄酮类化合物或总间苯三酚类化合物［5］。本研究应用HepG2细胞裸小鼠异位移植瘤模型，通过测定抑瘤率及检测相关生化指标、HE染色、免疫组化等方法了解刺头复叶耳蕨总黄酮抗肿瘤作用机制。

1 材料与仪器

1.1 样品与试剂 刺头复叶耳蕨根茎采自江西省星子县，由九江学院基础医学院高春华教授鉴定为鳞毛蕨科（Dryopteridaceae）复叶耳蕨属（Arachniodes）刺头复叶耳蕨（Arachniodes exilis Ching）；刺头复叶耳蕨总黄酮：取刺头复叶耳蕨75%乙醇提取液浓缩后经聚酰胺纯化得到刺头复叶耳蕨洗脱液，浓缩、冷冻干燥而得；测定总黄酮的量为82.86%。5-氟尿嘧啶 （5-FU）针剂 （上海旭东海普药业有限公司，批号121208）；DMEM/F-12培养基（HyClone）；胎牛血清［TransGen Biotech（TRANS）］；胰蛋白酶、二甲基亚砜 （DMSO）、琼脂糖（Solarbio公司）；DMSO（AR，天津科密欧化学试剂公司）；总蛋白提取试剂盒 （北京艾德莱公司）；4%多聚甲醛固定液、苏木精-伊红染色液（湖北百奥斯生物科技有限公司）；Bcl-2、Bax免疫组化试剂盒（美国eBioscience公司）；其余所有试剂，均为分析纯。

1.2 细胞株与实验动物 人肝癌HepG2细胞株由同济医院肝胆外科提供。BALB/c-nu免疫缺陷裸小鼠 （SPF级）25只，4～5周龄，雄性，购自湖南长沙斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号SCXK（湘）2009-0004。

1.3 主要仪器 BT224S型电子天平 （德国赛多利斯）；CO2恒温细胞培养箱 （SIM公司）；离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Olympus-Ckx41荧光倒置显微镜 （日本Olympus公司）；游标卡尺 （哈尔滨量具刃具集团公司）；细胞计数板（上海爱宝医疗器械有限公司）。

2 方法

将HepG2细胞接种于DMEM培养基（含10%的胎牛血清），在37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，每隔2～3 d换液一次至细胞生长至铺满瓶底90%左右时传代。

在免疫缺陷的裸小鼠体内异位移植人肝癌HepG2细胞，建立动物肝癌异位移植性肿瘤模型，通过分组给药，对肿瘤生长相关指标进行评价，对相关生物样品进行生化、病理检测，对肿瘤组织中部分凋亡相关蛋白的表达进行检测，探讨刺头复叶耳蕨总黄酮体内抗肿瘤作用及其机制。

2.1 样品配制 阴性对照：精密称取羧甲基纤维素钠（CMC-Na）1.0 g置于200 mL蒸馏水中，充分溶胀，加热溶解，配制成为0.5%CMC-Na溶液。阳性对照：取5-FU适量加入蒸馏水配制成为相应质量浓度对照溶液。样品溶液：分别精密称取一定量的刺头复叶耳蕨总黄酮样品，加适量0.5%CMC-Na溶剂，混合均匀配制不同质量浓度样品溶液。

2.2 动物肿瘤模型的制备 取处于对数生长期的HepG2细胞，以不含血清的培养液冲洗2次，重悬，调整计数至约为1×107/mL。分别吸取以上细胞悬液0.2 mL接种于每只裸鼠的背部皮下。

2.3 给药分组 免疫缺陷的裸小鼠接种人肝癌HepG2细胞后密切观察其接种部位的肿瘤生长情况。将试验动物随机分为阴性对照组，阳性对照组，刺头复叶耳蕨低剂量组、高剂量组，每组6只，分别以0.5%CMC-Na溶液、10 mg/kg 5-FU、500 mg/kg总黄酮、125 mg/kg总黄酮进行给药。各组动物均采用腹腔注射 （ip）给药，隔天给药一次，连续4周。观察肿瘤生长情况。

2.4 评价指标 在裸小鼠体外测量肿瘤的长径（a）及短径 （b），计算体积 （V，mm2）；计算相对肿瘤体积（RTV）。V=（a×b2）/2，RTV=Vt/ V0（V0为首次分组给药时测得的肿瘤体积，Vt为以后每次测量时的肿瘤体积）。

2.5 病理检测 各组实验动物给药结束后，处死并进行解剖，分别收集其血样及肿瘤组织；取血液标本进行部分相关生化指标检测；取部分肿瘤组织标本，以4%多聚甲醛溶液固定，进行相关病理检测，冻存其余肿瘤组织。

2.5.1 血液分析 取各组全血样本进行相关血液分析，对血样中红细胞 （RBC）、白细胞 （WBC）、血小板 （PLT）分别计数，测定血红蛋白（Hb）量。

2.5.2 组织形态观察 取各组肿瘤组织按照苏木精-伊红 （HE）染色法进行染色，在显微镜下观察其形态。

2.5.3 免疫组织化学分析［6］取各组实验动物肿瘤组织，常规制片，分别按Bcl-2、Bax的免疫组化试剂盒说明书方法，对其进行免疫组织化学检测，分析Bcl-2、Bax蛋白在肿瘤组织中的表达情况。

3 结果

3.1 实验动物一般状况的观察 在接种HepG2细

胞一段时间后，各实验动物可见接种部位的皮下出现明显肿块，表明异位移植人肝癌HepG2细胞裸小鼠肿瘤模型建立成功；各组实验动物在实验过程中饮食、饮水及排泄均正常，基本状况表现良好；实验结束后对各组实验裸小鼠进行解剖观察，无明显脏器损伤。

3.2 刺头复叶耳蕨总黄酮对肝癌模型裸鼠肿瘤生长的影响 结果见图1，与阴性对照组动物进行比较，实验动物用不同质量浓度的刺头复叶耳蕨总黄酮样品溶液进行治疗后，其移植瘤生长速度明显下降，显示刺头复叶耳蕨总黄酮具有良好的抑制人肝癌异位移植瘤模型裸鼠体内肿瘤生长的作用。

图1 刺头复叶耳蕨总黄酮对裸鼠肿瘤生长的影响Fig.1 Effects of Arachniodes exilis totaI fIavonoids on the grow th of tumor in nudem ice

对各实验动物组的相对肿瘤体积变化情况进行统计分析，结果见图2。

图2 各组肝癌异位移植瘤模型裸鼠的相对肿瘤体积的变化Fig.2 Changes of the reIative tumor voIumes of tumorbearingm ice in each group

3.3 刺头复叶耳蕨总黄酮对肝癌模型裸鼠血液的影响 结果见表1。分组给药4周后，对各组实验动物的血液部分生化指标检测结果统计分析发现，阳性对照组 （5-FU给药组）与阴性对照组实验动物比较，其相应血小板指标的检测结果有显著性差异，证明5-FU对实验动物血液具有一定毒性。而不同质量浓度刺头复叶耳蕨总黄酮处理组与阴性对照组实验动物各检测结果统计分析无显著性差异，这就提示了刺头复叶耳蕨总黄酮对模型裸鼠无明显的血液损伤。

3.4 肿瘤组织形态学观察 各组实验动物肿瘤组织的HE染色结果如图3所示，阴性对照组裸鼠的肿瘤组织中癌细胞排列较紧密、核大且具异型性、核胞质比大；而经不同剂量刺头复叶耳蕨总黄酮和阳性对照5-FU处理后的模型动物肿瘤组织中细胞排列较稀疏，可见细胞皱缩、破碎、染色质消失等现象，表现出了不同程度的坏死。

表1 裸鼠血液学指标的检测Tab.1 Assays of the haematoIogicaI indexes of nudem ice

表1 裸鼠血液学指标的检测Tab.1 Assays of the haematoIogicaI indexes of nudem ice

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05

组别 红细胞/（×1012.L-1） 白细胞/（×109.L-1） 血小板/（×109.L-1） 血红蛋白/（g.L-1）9.60±1.62 12.26±2.43 686.20±105.99 163.18±24.01刺头复叶耳蕨总黄酮低剂量组 9.54±1.75 12.14±2.39 678.02±128.52 165.60±15.92刺头复叶耳蕨总黄酮高剂量组 9.18±1.34 11.66±1.34 669.42±95.46 158.49±27.73阳性对照组 9.12±1.31 7.56±1.44*阴性对照组618.78±93.81 154.74±26.53

图3 各组裸鼠肿瘤组织HE染色Fig.3 HE stainings of tumor tissues beIonging to nude m ice in different groups

3.5 免疫组织化学法检测 运用免疫组织化学方法对各组实验动物肿瘤组织中Bcl-2、Bax的蛋白表达进行了检测，结果见图4、图5。

如图4所示，经过不同剂量的刺头复叶耳蕨总黄酮处理后，与阴性对照组相比，实验动物肝癌异位移植瘤模型裸鼠肿瘤组织中抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达阳性率明显降低。

如图5所示，经过不同剂量的刺头复叶耳蕨总黄酮处理后，与阴性对照组比较，实验动物肿瘤组织中的促凋亡蛋白Bax的表达阳性率明显增加；结合抗凋亡蛋白Bcl-2的测定结果，说明经过不同剂量的刺头复叶耳蕨总黄酮处理后，可能引起模型动物肿瘤组织中肝癌细胞的凋亡。

4 讨论

本研究通过建立肝癌异位移植瘤模型，考察了刺头复叶耳蕨总黄酮的体内抗肿瘤作用。通过观察药物对模型动物的肿瘤生长的影响，测定部分血液学指标以及对肿瘤组织进行HE染色观察组织坏死情况等试验，证实刺头复叶耳蕨总黄酮能够抑制肝癌异位移植瘤模型动物体内肿瘤生长，同时其对实验动物的血液系统没有明显的影响，提示其在体内应用时可能不良反应较少发生。

图4 肿瘤组织中凋亡相关蛋白BcI-2的表达Fig.4 Expressions of apoptosis-reIated protein BcI-2 in tumor tissues

图5 肿瘤组织中凋亡相关蛋白Bax的表达Fig.5 Expressions of apop tosis-reIated p rotein Bax in tumor tissues

为进一步研究刺头复叶耳蕨总黄酮体内抗肿瘤作用机制，我们采用免疫组织化学方法对肝癌细胞增殖抑制相关蛋白进行了测定，结果显示：经刺头复叶耳蕨总黄酮处理后，实验动物肿瘤组织中的促凋亡蛋白Bax的表达水平明显升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显下调；相应Bax/Bcl-2比例增大。Bcl-2家族作为复杂作用网络共同参与细胞凋亡的调控，成为恶性肿瘤治疗的靶标之一［7］。Bcl-2家族包括抑凋亡基因群（如Bcl-2、Bcl-xl

等）和促凋亡基因群 （如Bax、Bad等），各基因群发挥不同的作用，促进凋亡与抑制凋亡作用相互制约，其中Bax和Bcl-2基因具有40%的同源性［8-9］，当Bax/Bcl-2比例较高时，细胞趋于凋亡，反之则细胞凋亡下降［10-12］。免疫组织化学实验结果显示肝癌移植瘤模型裸鼠肿瘤组织中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平降低，促凋亡蛋白Bax的表达水平明显升高，从整体动物水平证实了刺头复叶耳蕨总黄酮抗肿瘤作用与其促肿瘤细胞凋亡相关。

本项实验采用了肝癌异位移植瘤模型裸鼠作为实验动物，初步评价了刺头复叶耳蕨总黄酮体内抗肝癌的效果，并探讨了其在体内抗癌作用的可能机制。肝癌异位移植瘤动物模型操作简单、肿瘤潜伏期短、模型成瘤率高，并且具有便于从体外观察等特点［13-14］，能大大缩短实验周期，适用于对抗肿瘤药物的筛选。

在今后的实验中，还需要通过增加实验动物的例数以使得实验结果更加准确可靠、更具有说服力，此外还可使用其他肝癌动物模型来验证刺头复叶耳蕨总黄酮的体内抗肝癌作用。

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Anti-tumor effect of totaI fIavonoids from Arachniodes Exilis Ching in vivo

LIHui-min1， YIN Chang-chang1， JIANG Deng-zhao2

（1.Basic Medical Gollege of Jiujiang University，Jiujiang 332000，Ghina；2.School of Pharmacy and Life Sciences，Jiujiang University，Jiujiang 332000，Ghina）

AIM To investigate the effects of total flavonoids from Arachniodes Exilis Ching on anti-tumor activity in vivo.METHODS HepG2 cell heterotopic graftmodelwas setup in nudemice，inhibitory rate and biochemical indices were determined，then HE staining and immunohistochemistry were performed to determine its mechanism of action.RESULTS Tumor growth in nudemicewith hepatoma heterotopic graftwas inhibited by total flavonoids from A.Exilis.Ithad no significant influence with theweightand blood system of experimentalmice. Meanwhile，the expression levels of pro-apoptotic protein Bax in tumor tissue weremarkedly increased.However，anti-apoptotic protein Bcl-2 expression levelsweremarkedly reduced.CONCLUSION Studies on anti-tumor activity in vivo show that the anti-tumor effects of total flavonoids from A.Exilis may be related to induced-apoptosis of tumor cells.

Arachniodes Exilis Ching；total flavonoids；nudemice；HepG2 cell；proliferation

R285.5

A

1001-1528（2015）11-2347-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.003

2014-12-01

国家自然科学基金 （81160536）；江西省教育厅资助项目 （GJJ12737）

李辉敏 （1974—），女，博士，副教授，从事中药药效物质基础与作用机制研究。Tel：（0792）8568166，E-mail：13970280063@163.com