不同制备工艺的健脑益智胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用

郭东艳， 范 妤， 赵晓平， 覃鸿恩

（1.陕西中医药大学，陕西咸阳712046；2.陕西中医药大学附属医院，陕西咸阳712000）

不同制备工艺的健脑益智胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用

郭东艳1， 范 妤1， 赵晓平2， 覃鸿恩1

（1.陕西中医药大学，陕西咸阳712046；2.陕西中医药大学附属医院，陕西咸阳712000）

目的 研究不同制备工艺的健脑益智胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用。方法 150只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、原药液组、醇沉组、壳聚组、膜分离组。然后，建立大脑中动脉缺血 （MCAO）再灌注损伤模型，观察不同制备工艺的健脑益智胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经行为学评分和脑梗死体积的影响，并检测脑组织中丙二醛 （MDA）和一氧化氮 （NO）含有量，以及超氧化物歧化酶 （SOD）和还原型谷胱甘肽过氧化酶 （GSHPX）活性，免疫组化法检测脑组织中TNF-α和NF-κB表达。结果 不同制备工艺的健脑益智胶囊均可显著降低脑缺血再灌注大鼠所致的神经行为学评分，减少脑梗死比率和脑组织MDA及NO水平，提高T-SOD和GSH-PX活力，抑制NF-κB信号通路上TNF-α和NF-κB表达。其中，醇沉组的改善作用更为明显。结论 健脑益智胶囊对缺血再灌注损伤大鼠具有明显保护作用，其机制可能与改善神经功能、减少自由基损伤和抑制炎症因子表达有关。而且，不同制备工艺的药物对其神经保护作用有所差异，其中醇沉组作用最显著。

健脑益智胶囊；制备工艺；脑缺血再灌注损伤；神经行为学；自由基；炎症因子

健脑益智胶囊由水蛭、葛根、郁金、石菖蒲、白茅根等中药组成，具有豁痰开窍、活血化瘀、通脉益智作用，临床上主要用于预防和治疗外部颅脑损伤、缺血性脑损伤、脑震荡及脑水肿等疾病［1-4］。为了提高健脑益智胶囊的质量以及降低临床服药量，本实验将在前期提取工艺研究的基础上［5］，考察不同制备工艺的健脑益智胶囊对大鼠脑缺血模型的影响，为进一步筛选其制备工艺提供可靠的实验依据。

1 材料

1.1 药品 葛根 （批号121101，产地广西）、白茅根 （批号130401，产地陕西）、郁金 （批号130101，产地广西）、石菖蒲 （批号130401，产地四川）饮片 （西安盛兴中药饮片有限责任公司），经陕西中医药大学王继涛老师鉴定，分别为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根、禾本科植物白茅Imperata cylindrica Beauv.Var.major（Nees）C.E.Hubb的干燥根茎、姜科植物温郁金Gurcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥块根、天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott的干燥根茎。葛根素对照品 （批号110752-201313，中国食品药品检定研究院）；壳聚糖 （批号69047438，国药集团化学试剂有限公司）；

甲醇、乙腈均为色谱纯 （德国Merck公司）；水为超纯水（自制）；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器 UV-2550紫外可见分光光度计 （日本岛津公司）；L-520离心机 （湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）；HH-2恒温水浴锅 （北京科伟永兴仪器有限公司）；GB204电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Leica DM4000B生物显微镜 （德国徕卡公司）；GQ76管式离心机 （上海市离心机械研究所有限公司）；PFT-A500电子天平 （福州华志科学仪器有限公司）。

1.3 实验试剂 2，3，5-氯化三苯基四氮唑 （TTC，美国Sigma公司）；一氧化氮 （NO，批号A012）、总超氧化物歧化酶 （T-SOD，批号A001-1）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX，批号A005）、丙二醛 （MDA，批号A003-1）、蛋白定量测试盒 （批号A045-2）及试剂盒 （南京建成生物工程研究所）；TNF-α、NF-κB一抗、SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.4 实验动物 雄性SD大鼠150只，体质量300～350 g（西安交通大学动物实验中心，动物合格证号SCXK［陕］2013-003），饲养环境为SPF级。

2 方法

2.1 不同工艺健脑益智胶囊的制备 按处方比例称取白茅根、葛根、郁金和石菖蒲适量，其中往郁金和石菖蒲中加入10倍量水，浸泡2 h后提取6 h，收集挥发油和水溶液备用；往药渣、白茅根、葛根中加入10倍量水，煎煮2次，每次2 h，水煎液和蒸馏后的水溶液合并，过滤，即得水提液。然后，将水提液分成4等份，除1份备用外，其余3份分别进行醇沉［6］、壳聚糖［7］和膜分离［8］制备工艺处理；将挥发油分成4等份，分别加入原水提液及3种不同纯化工艺处理后的溶液中，混匀。接着，按处方比例称取水蛭适量，分成2份。其中，1份粉碎，过40目筛，60%乙醇回流提取2次，每次1 h，过滤，滤液浓缩至无醇味，分成4等份，分别加入上述4种溶液，混匀；另1份粉碎，过100目筛，分成4等份，分别加入上述4种溶液，混匀，干燥，粉碎，填充，即得不同制备工艺制备的健脑益智胶囊。

2.2 动物分组与给药 取体质量300～350 g的雄性大鼠150只，随机分成6组，每组25只，分别设置为假手术组、模型组、原药液组、醇沉组，壳聚组、膜分离组。其中，给药组提前给药一周，给药剂量按健脑益智胶囊内容物计，为0.6 g/100g，给药容积为1 mL/100 g。

2.3 大鼠脑缺血再灌注损伤模型的制备 将经 “2.2”项方法处理后的大鼠禁食不禁水12 h，参照Zea Longa改良法，建立左侧大脑中动脉梗塞 （MCAO）模型［9］。具体方法为大鼠腹腔注射10%水合氯醛3mL/kg麻醉，于颈部偏右侧切口，分离右侧颈总动脉 （CCA）、颈外动脉 （ECA）和颈内动脉（ICA），结扎右CCA近心端、ECA及其分支动脉。然后，分离右侧ICA，向下分离翼颚动脉，根部结扎动脉分支，在CCA近心端备线，另一端加动脉夹，在距离颈动脉分叉0.5 cm处剪开一小口，将处理后的渔线经ECA插入ICA，进到大脑中动脉分支处，用于阻断大脑中动脉的所有血流来源，缺血1.5 h后，拔出渔线，再灌注48 h。另外，假手术组只做动脉分离暴露，不插拴线，其余操作步骤相同。在手术过程中，大鼠体温保持在37℃左右。

2.4 神经行为评分 参照Bederson评分标准［10］，将缺血48 h后的大鼠进行神经功能评分。其中，0分为无神经功能缺损症状；1分为左侧前肢屈曲，不能完全伸直，提起时左上肢不能上抬；2分为行走时向左侧旋转；3分为行走时向左侧倾倒；4分为不能自己行走或昏迷。得分越低，表示动物神经损伤越小。

2.5 脑梗死范围检测 每组取大鼠5只，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后迅速断头，取出全脑，-20℃下冷冻20 m in，去除嗅球、小脑和低位脑干，将鼠脑平均横切成5段冠状脑片，立刻置于配制好的2%TTC染液中，37℃下避光孵育30min，每隔8min翻动一次，取出脑片，10%甲醛溶液固定。结果，梗塞区显示为白色，而非梗塞区显示为玫瑰红色。拍照后，用Adobe Photoshop Cs软件处理图像，用图像体积处理软件求出梗塞区体积，计算脑梗死灶比率，计算公式为脑梗死灶比率%=（梗塞区体积/全脑体积）×100%。

2.6 脑组织中MDA、NO、T-SOD、GSH-PX检测 每组取大鼠8只，缺血再灌注48 h后10%水合氯醛 （350 mg/kg）腹腔注射麻醉，迅速开颅取脑，称取大鼠缺血区和健侧相同部位的脑组织100 mg，加入0.9%生理盐水1 mL，4℃冰浴下在组织匀浆器中研磨，制成10%组织匀浆，3 000 r/min离心15 min，取上清液。然后，按试剂盒操作说明，考马斯亮蓝法测定总蛋白，羟胺法测定脑组织中MDA、NO、T-SOD、GSH-PX的含有量。

2.7 免疫组化法检测缺血侧脑组织TNF-α和NF-κB的表达 每组取大鼠8只，灌流固定后取缺血侧脑组织，常规固定、脱水、石蜡包埋后，制作标本切片，按试剂盒操作说明进行SABC染色和DAB显色，光镜（×400）下观察，阳性细胞为棕褐色着色。然后，每张切片随机取大脑皮质内视野计数阳性细胞5个，计数不分细胞种类。

2.8 统计学分析 利用SPSS 13.0软件进行统计学处理，实验数据均以表示，P＜0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 不同制备工艺的健脑益智胶囊对脑缺血再灌注大鼠神经功能评分和脑梗死体积的影响 脑缺血再灌注48 h后，进行神经行为学评分。结果显示，假手术组均正常；模型组与假手术组有非常显著的差异 （P＜0.01），行为学变化明显，说明造模成功；健脑益智胶囊不同制备工艺组均可显著改善脑缺血再灌注所致的神经行为障碍，与模型组比较，差异具有统计学意义 （P＜0.05），其中，醇沉组和膜分离组的改善作用更明显 （P＜0.01），见表1。

TTC染色结果显示，模型组脑组织中的白色梗死灶明

显，脑梗死比率为 （64.36±7.58）%，而健脑益智胶囊不同制备工艺组的梗死灶比率显著降低，差异具有统计学意义 （P＜0.01）。其中，醇沉组降低程度最为明显，脑梗死比率为 （29.86±8.78）%，见图1和表1。

表1 健脑益智胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠神经行为学评分和脑梗死体积比的影响

表1 健脑益智胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠神经行为学评分和脑梗死体积比的影响

组别 神经行为评分 脑梗死体积比率/%假手术组0 0模型组 2.63±0.52# 64.36±7.58##原药液组 2.00±0.53* 32.38±9.81**醇沉组 1.88±0.35** 29.86±8.78**壳聚糖组 2.00±0.53* 32.02±7.09**膜分离组 1.88±0.64* 38.11±6.80**

图1 大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织TTC染色结果

3.2 不同制备工艺的健脑益智胶囊对脑缺血再灌注大鼠脑组织MDA、NO、T-SOD、GSH-PX的影响 与假手术组比注：与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，

表2 健脑益智胶囊对脑缺血再灌注大鼠脑组织MDA、NO、T-SOD和GSH-PX的影响

表2 健脑益智胶囊对脑缺血再灌注大鼠脑组织MDA、NO、T-SOD和GSH-PX的影响

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 MDA/（nmol.mL-1） NO/（μmol.gprot-1） T-SOD/（U.mgprot-1） GSH-PX/（U.mgprot-1）11.06±3.45 17.74±4.53 148.45±25.54 56.84±5.13模型组 20.46±4.39## 30.24±4.29## 97.86±22.40## 37.02±5.09##原药液组 15.32±3.52* 24.13±3.98* 130.43±21.76* 47.47±5.34**醇沉组 13.34±4.32** 24.06±4.05* 140.76±22.21** 50.31±5.46**壳聚糖组 14.78±4.01* 24.64±4.45* 127.56±25.12* 48.21±6.12**膜分离组 16.24±3.21* 26.39±5.36 121.45±21.13* 46.67±6.35假手术组**

*P＜0.05，**P＜0.01较，模型组脑组织中MDA和NO水平明显升高（P＜0.01），T-SOD和GSH-PX水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，健脑益智胶囊不同制备工艺组脑组织中MDA和NO水平降低，T-SOD和GSH-PX水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。其中，醇沉组MDA、T-SOD、GSH-PX的变化最为显著，见表2。

3.3 不同制备工艺的健脑益智胶囊对脑缺血再灌注大鼠脑组织TNF-α、NF-κB表达的影响 与假手术组比较，模型组大脑皮质中TNF-α和NF-κB的表达显著增强，差异具有统计学意义 （P＜0.01）；与模型组比较，健脑益智胶囊不同制备工艺组脑组织中TNF-α和NF-κB的阳性表达细胞数明显减少，而且着色强度减弱，差异具有统计学意义（P＜0.05）。其中，醇沉组对TNF-α和NF-κB表达有更明显的抑制作用，见表3、图2、图3。

表3 健脑益智胶囊对脑缺血再灌注大鼠脑组织中TNF-α和NF-κB表达的影响

表3 健脑益智胶囊对脑缺血再灌注大鼠脑组织中TNF-α和NF-κB表达的影响

组别 NF-κB TNF-α 12.91±1.92 8.83±2.71模型组 30.63±2.26## 58.25±5.43##原药液组 20.22±2.59** 2.00±0.53*醇沉组 22.09±1.58** 1.88±0.35**壳聚糖组 18.94±2.70** 2.00±0.53*膜分离组 24.44±2.13** 1.88±0.64假手术组*

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

4 讨论

缺血性脑血管病是临床常见和多发病，具有恢复慢、致残率高、复发率高等特点，而缺血再灌注损伤是导致病情加重的重要原因。大量研究显示，氧化应激和炎症反应是脑缺血再灌注损伤的主要原因，其中，自由基过量蓄积是造成脑缺血再灌注后神经组织损伤的重要环节。当脑缺血损伤时，氧化应激反应导致机体内自由基大量堆积，进而破坏不饱和脂肪酸双链的生物膜结构，引发脂质过氧化“瀑布状”连锁反应，产生大量脂质过氧化物 （如丙二醛MDA、一氧化氮 NO），远远超过了超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽 （GSH-PX）等自由基清除剂的抗氧化能力。当形成的自由基显著增多时，SOD和GSH-PX消耗增加，其活性明显下降［11-13］，使膜性结构遭到破坏，蛋白降解，核酸主链断裂，透明质酸解聚，细胞崩解并发生不可逆性改变［14］。

本实验在前期研究的基础上，采用不同制备工艺制得健脑益智胶囊，然后建立大鼠左侧大脑中MCAO模型，观察其对缺血性脑损伤的改善作用。结果表明，不同制备工艺组药物均能显著降低脑组织中MDA和NO的含有量，并增加SOD和GSH-PX的活性，显示健脑益智胶囊能通过对抗自由基和过氧化损伤来保护脑组织。其中，醇沉组的作用最为显著。

图2 大鼠大脑皮质中TNF-α的阳性表达（×400）

图3 大鼠大脑皮质中NF-κB的阳性表达（×400）

另外，炎症反应也是导致脑缺血再灌注损伤发生的重要原因。NF-κB信号通路是细胞活动的关键媒介［15-16］，而NF-κB是细胞内最重要的核转录因子之一，广泛分布于神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中。在静息状态下，NF-κB与其抑制因子IκB结合，形成复合物，以无活性形式存在于胞浆中；在应激条件下，IκB激酶复合物被磷酸化后降解，胞浆中游离的NF-κB迅速转运到胞核，与特异性κB序列结合，诱导下游TNF-α等多种促炎症因子的表达，导致炎症反应产生［17］。本实验结果显示，健脑益智胶囊不同制备工艺组均能显著抑制NF-κB信号通路上NF-κB和TNF-α的表达，通过抑制NF-κB活化，从而减少TNF-α生成，抑制炎症级联反应发生。其中，醇沉组的抗炎作用最好。

综上所述，健脑益智胶囊能通过改善脑缺血再灌注损伤后神经功能缺失，减小脑梗死体积，对抗自由基损伤，减轻炎症反应，从而实现缺血后神经保护的作用。而且，不同制备工艺组对其神经保护作用有所差异，其中醇沉组作用最显著。

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R285.5

B

1001-1528（2015）11-2530-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.045

2014-12-15

陕西省科技厅资助项目 （2011KTCL03-02）

郭东艳 （1973—），女，博士，教授，从事中药新制剂开发研究。Tel：（029）38185180，E-mail：winter180@163.com