欣怡胶囊对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清炎症因子及心脏组织形态的影响

吴珍妮， 胡满燕， 龙子江*， 周宜轩

（1.安徽中医药大学，安徽合肥230038；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽合肥230038）

欣怡胶囊对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清炎症因子及心脏组织形态的影响

吴珍妮1， 胡满燕1， 龙子江1*， 周宜轩2

（1.安徽中医药大学，安徽合肥230038；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽合肥230038）

目的 观察欣怡胶囊 （丹参、红参、水蛭、麝香）对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血清炎症因子水平的影响及心肌组织形态的改变，探讨其心脏保护作用及机制。方法 SD大鼠随机分为模型组和假手术组 （均为蒸馏水），欣怡胶囊高、中和低剂量组，复方丹参滴丸组。各给药组按剂量灌胃给药7 d，末次给药后，结扎冠状动脉左前降支建立心肌缺血再灌注模型，假手术组只穿线不结扎。记录心电图ST段的变化；采用酶联免疫吸附法 （ELISA）测定各组大鼠血清磷酸肌酸激酶同工酶 （CK-MB）、乳酸脱氢酶 （LDH）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、巨噬细胞移动抑制因子 （MIF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平；HE染色观察心肌组织形态改变。结果 欣怡胶囊能够使心肌缺血再灌注损伤抬高的ST段降低（P＜0.01、0.05），降低CK-MB、LDH的活性及MCP-1、MIF、TNF-α水平（P＜0.01、0.05），改善了大鼠心肌组织形态学的损伤性变化。结论 欣怡胶囊能通过降低炎症因子的水平和抑制大鼠缺血再灌注损伤来发挥心肌保护作用。

欣怡胶囊；心肌缺血再灌注损伤；单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）；巨噬细胞移动抑制因子 （MIF）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指对缺血时间较长的心肌恢复血流后，再灌注心肌的损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤［1］。单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）与急性冠脉综合征 （ACS）的发生具有显著相关性，可作为ACS一个预测指标［2］。其与促炎因子巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhbitory factor，MIF）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）关系密切，共同参与并促进了炎症的发展，在心肌梗死中发挥了重要作用。欣怡胶囊是安徽中医药大学第一附属医院周宜轩教授总结临床经验，研制出的中药制剂，由丹参、红参、水蛭、麝香4味中药组成，具有活血化瘀、益气通络、宣痹止痛的功效。其治疗冠心病在动物实验及临床试验中皆得到较满意的疗效［3］。本实验通过检测大鼠血清MIF、MCP-1、TNF-α的水平，旨在进一步研究欣怡胶囊是否对缺血再灌注损伤大鼠有保护作用并探讨其可能机制。

1 实验材料

1.1 动物 雄性SD大鼠 （230±20）g（安徽医科大学动物中心提供），动物生产许可证号SCXX（皖）2005-001。

1.2 实验药物与试剂 欣怡胶囊 （安徽济人药业股份有限公司，批号130501），此方由丹参、红参、水蛭、麝香4味中药组成；复方丹参滴丸（天津天士力股份有限公司，批号131215）；临用前均用蒸馏水配制成所需质量浓度。大鼠乳酸脱氢酶（LDH）（南京建成科技有限公司，批号E-30385）；磷酸肌酸激酶同工酶 （CK-MB）（南京建成科技有限公司，E-30718）；大鼠巨噬细胞移动抑制因子 （MIF）（南京建成科技有限公司，批号E-30576）；大鼠单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）（南京建成科技有限公司，批号E-30494）；大鼠肿瘤坏死因子 （TNF-α）（南京建成科技有限公司，批号E-30633）；水合氯醛 （上海强顺化学试剂有限公司，批号20100104）。

1.3 主要仪器 XD-7100型心电图仪 （上海医用电子仪器厂）；HX-300动物呼吸机 （成都泰盟科技有限公司）；佳能数码相机；奥林巴斯AU640全自动生化仪；YBL-2生物组织包埋机（孝感亚光医用生物科技研究所）；YT-6生物组织烘烤机 （孝感亚光医用生物科技研究所）；LEICA RM234石蜡切片机 （莱卡上海分公司）；JW 3021HR型离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组和给药 健康雄性SD大鼠60只随机分为假手术组、模型组、阳性对照组 （复方丹参滴丸：临床人日用剂量为0.81 g，按体表面积折算，大鼠每日给药量30 mg/kg）、欣怡胶囊高、中、低剂量组 （临床人日用生药量18.02 g，同法折算得大鼠每日给药量8.4、4.2、2.1 g/kg）。药物组连续灌胃给药7 d，其余两组给予等容积生理盐水同法操作，各组每日给药一次。

2.2 模型建立 模型的建立参照经典MIRI造模方法并与实际结合如下所述：术前禁食12 h，末次给药30 min后，采用3.5%的水合氯醛（1 mL/ 100 g）腹腔注射麻醉后将大鼠仰卧固定于手术台上。针形电极插入四肢皮下，连接心电图机，记录正常Ⅱ导联心电图。在胸骨左侧约0.5 cm处，第3、4肋间切口；钝性分离至肋间隙，用弯头钳打开胸腔，挤压心脏，使其充分暴露；在左心耳和肺动脉圆锥间找到与左冠状动脉伴行的冠状静脉，在左心耳下方2 mm处以5～0无损伤缝合针穿线，进针深度为1.0～1.5 mm，宽度为2～3 mm；结扎前于冠状静脉处放置棉线，连同棉线 （1.5～2.0 mm）一起结扎冠状动脉前降支，造成心肌缺血。30 min再次开胸，剪断结扎线，使其再灌注120 min，假手术组按同法操作，但只穿线不结扎。经口腔插入橡皮管连接小动物呼吸机给予人工机械呼吸，频率45～50次/min，潮气量1～2 mL/ 100 g，呼吸比5：3。

模型复制成功的标准：Ⅱ导联心电图ST段在结扎后明显抬高表示心肌缺血成功复制，再灌注模型成功复制为剪断结扎线后，抬高的ST段下降1/2以上［4］。造模过程中每组1～2只大鼠由于心室颤动、气胸或大出血等原因死亡。各组取8只进行有关指标检测。

2.3 指标检测

2.3.1 大鼠心电图J点变化 分别于冠状动脉结扎前、结扎后30 min和再灌注后30、60、120 min记录心电图。观察II导联ST段的变化，用游标卡尺测量心肌缺血前后和再灌注前后ST段高度并统计数据。

2.3.2 大鼠血清心肌损伤酶LDH、CK-MB水平的测定 再灌注120 min结束后，3.5%水合氯醛（1 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血5 m L，3 000 r/min离心15 min，取血清，采用酶联免疫吸附法 （ELISA）测定各组大鼠血清心肌损伤酶LDH、CK-MB水平。检测步骤按照各试剂盒说明书依法操作。

2.3.3 大鼠血清MCP-1、MIF、TNF-α水平的测定 方法同“2.3.2”项测定MCP-1、MIF、TNF-α水平。

2.3.4 心肌组织形态学观察 再灌注结束后，处死大鼠，取心脏左心室组织置于10%中性甲醛溶液中固定1周，常规梯度脱水、石蜡包埋，切片，厚度为5μm，HE染色，观察各组大鼠心脏组织形态。

2.4 数据分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。数据结果以表示，定量资料多组间两两比较采用方差分析 （方差齐采用LSD检验，方差不齐者采用Dunnett t检验）。

3 结果

3.1 欣怡胶囊对MIRI大鼠心电图的影响 结果如表1所示，模型组大鼠心肌缺血30 min，再灌注30、60、120 min心电图ST段明显抬高，假手术组变化不明显，二者相比有显著性差异 （P＜0.01）。与模型组相比，药物组ST段都有下降趋势，部分差异具有统计学意义 （P＜0.01或P＜0.05）。

表1 欣怡胶囊对心肌缺血再灌注后大鼠心电图ST段的影响Tab.1 Effects of Xinyi Capsu Ies on ECG-ST in m yocardia Iischem ia-reperfusion rat

表1 欣怡胶囊对心肌缺血再灌注后大鼠心电图ST段的影响Tab.1 Effects of Xinyi Capsu Ies on ECG-ST in m yocardia Iischem ia-reperfusion rat

注：与假手术组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与模型组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05

30 min 60 min 120 min假手术组 —组别 剂量/（g.kg-1） 正常心电图 缺血30 min心电图 再灌注后心电图0.094 5±0.013 0.118±0.011 0.116±0.035 0.118±0.022 0.116±0.012模型组 — 0.105±0.013 0.33±0.032** 0.297±0.025** 0.281±0.051** 0.232±0.028**欣怡胶囊高剂量组 8.4 0.113±0.03 0.23±0.038△ 0.183±0.026△△0.167±0.066△△ 0.117±0.043△△欣怡胶囊中剂量组 4.2 0.108±0.019 0.292±0.035 0.199±0.031△△0.153±0.044△△ 0.125±0.029欣怡胶囊低剂量组 2.1 0.092±0.011 0.258±0.023△△ 0.224±0.044△△0.174±0.017△△ 0.149±0.038△△复方丹参滴丸组 3×10-2 0.011 4±0.023 0.268±0.105 0.188±0.022△△0.144±0.096△△ 0.117±0.048△△

3.2 欣怡胶囊对MIRI模型大鼠血清心肌损伤酶CK-MB、LDH的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清CK-MB、LDH水平显著上升，差异均具有统计学意义 （P＜0.01）；与模型组比较，欣怡胶囊高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性组血清CK-MB水平明显下降，具有显著性差异 （P＜0.01），欣怡胶囊高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性组LDH水平显著下降，差异具有统计学意义 （P＜0.01或P＜0.05），见图1。

图1 欣怡胶囊对心肌缺血再灌注后大鼠血清CK-MB（A）、LDH（B）的影响Fig.1 Effects of Xinyi Capsu Ies on CK-MB（A），LDH（B）IeveIs in serum ofm yocardiaIischem ia-reperfusion injured rats

3.3 欣怡胶囊对MIRI模型大鼠血清MCP-1、MIF、TNF-α的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清MCP-1、MIF、TNF-α水平显著升高，具有显著性差异 （P＜0.01）；与模型组比较，欣怡胶囊高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性组血清MCP-1、MIF、TNF-α水平下降，有明显差异（P＜0.05），见表2。

表2 欣怡胶囊对M IRI模型大鼠血清MCP-1、M IF、TNF-α水平的影响Tab.2 E ffects of Xinyi Capsu Ies on M CP-1，M IF，TNF-αin IeveIs in serum of m yocardiaI ischem ia-reperfusion inju red（M IRI）rats

表2 欣怡胶囊对M IRI模型大鼠血清MCP-1、M IF、TNF-α水平的影响Tab.2 E ffects of Xinyi Capsu Ies on M CP-1，M IF，TNF-αin IeveIs in serum of m yocardiaI ischem ia-reperfusion inju red（M IRI）rats

注：与假手术组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与模型组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05

组别 剂量/（g.kg-1） MCP-1/（ng.L-1） MIF/（μg.L-1） TNF-α/（ng.L-1）假手术组 —251.34±7.93 22.96±2.02 121.73±6.10模型组 — 283.72±14.77** 28.40±3.03** 165.84±25.64**欣怡胶囊高剂量组 8.4 267.62±5.62△△ 24.26±1.70△△ 131.08±16.21△△欣怡胶囊中剂量组 4.2 262.24±6.43△△ 25.79±1.30△ 140.56±9.467△欣怡胶囊低剂量组 2.1 266.18±16.74△ 25.89±1.08△ 143.51±7.99△复方丹参滴丸组 3×10-2 262.56±10.94△△ 24.22±2.00△△ 133.40±17.71△

3.4 欣怡组织形态学观察结果 光镜下观察，假手术组可见心肌纤维完整、细胞间排列紧密、核仁清晰、横纹清晰，未见坏死灶及炎性细胞浸润（图2-a）。模型组可见大鼠心肌纤维断裂、心肌细胞排列紊乱、出现核固缩、细胞形态模糊、横纹不清、炎症细胞浸润、细胞间隙增大等 （图2-b）。阳性组 （图2-c）、欣怡胶囊高剂量组 （图2-d）、中剂量组 （图2-e）、低剂量组 （图2-f）与模型组比较炎症细胞浸润较轻、心肌细胞排列整齐，心肌走向较清晰。

图2 欣怡胶囊对M IRI大鼠心肌组织形态学的影响（HE，×400）Fig.2 E ffects of Xinyi Capsu Ies on m yocardium tissue patho Iogies in M IRI rats（HE，×400）

4 讨论

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是目前全球发病率和病死率较高的疾病之一。临床上常采用血栓溶栓术、血管成形术、冠状动脉搭桥术及心脏移植术等对阻塞后的冠状动脉血管进行恢复血流治疗。MIRI则是其治疗后严重的并发症之一［5］。心肌细胞膜在MIRI时常导致细胞内LDH、CK-MB外漏，故二者常被作为临床上判断心肌损伤的特异性指标［6］。本实验发现，欣怡胶囊对MIRI模型大鼠进行预处理后CK-MB、LDH的水平均显著降低。HE染色显示，模型组大鼠心肌纤维断裂、心肌细胞排列紊乱、出现核固缩、细胞形态模糊、横纹不清、炎症细胞浸润、细胞间隙增大等。应用欣怡胶囊干预后，炎症细胞浸润较轻、心肌细胞排列整齐，心肌走向较清晰，细胞形态较模型组明显改善。表明应用欣怡胶囊治疗MIRI模型大鼠能减少CK-MB、LDH的外漏，并在一定程度上保护了细胞膜的完整性，增强心肌细胞对抗MIRI的能力。

心肌梗死后，在损伤局部会有炎症产生并生成

多种趋化因子，加重了炎症细胞的浸润。MCP-1是独立预测冠心病的特异的单核细胞因子之一，与冠心病关系密切［7-8］。Arakelyan A［9］等研究发现AMI患者的血清MCP-1水平明显升高。MCP-1主要由内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞以及单核细胞产生，其能趋化并激活单核/巨噬细胞迁移并聚集在血管内膜下并抑制其随机移动和化学趋化性，后活化为巨噬细胞，吞噬类脂质，形成富含胆固醇酯的泡沫细胞［10-11］。现已有研究证明可将其作为预测ACS一个指标［2］。MIF是近年来研究发现的一种新的炎性反应标志物，与炎症、血管等方面的疾病有关。余文辉等［12］研究发现，AMI患者血浆MIF水平明显升高。MIF主要由巨噬细胞、T淋巴细胞及单核细胞、泡沫细胞分泌与释放。其作用机制通过诱导促进MCP-l的表达，并经依赖MCP-1的作用机制聚集巨噬细胞发挥作用。MIF作为前炎症因子还可以通过促进巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6、IL-8等多种细胞因子，产生炎症放大效应间接的发挥炎症调节功能［13-14］。TNF-α由巨噬细胞产生，是体内重要的炎症因子，可通过自分泌效应作用于其它巨噬细胞，引起更多巨噬细胞进一步活化，使炎症反应扩大［15］。其中MIF与TNF-α都可以通过刺激巨噬细胞相互促进彼此的释放从而构成了一个复杂的炎症反应系统。此外，在心肌细胞中TNF-α也可以诱导MCP-1的表达。而通过本实验发现，模型组大鼠血清MCP-1、MIF、TNF-α浓度显著升高；欣怡胶囊对MIRI模型大鼠进行干预后血清MCP-1、MIF与TNF-α的水平都明显下降，减轻了心肌细胞损伤，提示MCP-1、MIF、TNF-α可能成为预测MIRI的指标。

综上所述，欣怡胶囊预处理MIRI模型大鼠后可以减轻心肌损伤，保护心肌。这可能与减少细胞因子MCP-1、MIF、TNF-α的水平有关。

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InfIuence of Xinyi Capsu Ies on infIammatory factors and m yocardium tissue morphoIogy in ratsw ith m yocardiaI ischem ia-reperfusion injury

WU Zhen-ni1， HU Man-yan1， LONG Zi-jiang1*， ZHOU Yi-xuan2

（1.Anhui University of Traditional GhineseMedicine，Hefei230038，Ghina；2.First Hospital Affiliated to Anhui University of Traditional GhineseMedicine，Hefei 230038，Ghina）

AIM To observe the effects of XinyiCapsules（Salvia mitiorrhiza，Radix ginseng rubra，whitmania pigra，Moschus）on serum cell factor cytokine MCP-1，MIF，TNF-αand myocardium tissue morphology in myocardial ischemia-reperfusion injured（MIRI）rats and itsmechanism.M ETHODS SD rats were randomized into six groups，including themodel group and sham group（both fed with distilled water），Xinyi Capsules high，medium and low dose groups，and Compound Danshen Dripping Pills group，successive administering for seven days.The ratsweremolded MIRI by closing the left anterior descending coronary artery after the last administration.ST segment changes were recorded，blood samples were collected from the abdominal vein，the serum was measured for the levels of MCP-1，MIF and TNF-αby ELISA and myocardium tissuemorphology was observed by HE staining.RESULTS Compared with themodel group，the experiment data revealed that Xinyi Capsules attenuated ST segment elevation and serum levels of CK-MB，LDH，MCP-1，MIF and TNF-αin the drug therapy groups decreased significantly while ameliorated myocardium pathological changes.CONCLUSION Xinyi Cap-

Xinyi Capsules；ischemia-reperfusion injured；MCP-1（monocytechemoattractant protein-1）；MIF（macrophagemigration inhbitory factor）；TNF-α（tumor necrosis factor-α）

R285.5

A

1001-1528（2015）11-2342-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.002

2014-11-21

安徽省研究生 “千人计划”项目资助 （2015）

吴珍妮 （1991—），女，硕士生，从事中药对心脑血管疾病防治作用的研究。Tel：15209880225，E-mail：zhennijw@ 163.com

*通信作者：龙子江 （1957—），男，教授，从事中药对心脑血管疾病防治作用的研究。Tel：（0551）5169216，E-mail：lzjyls@ 163.com

sules play a role in cerebral protection inhibiting the MIRI and promoting myocardium possibly by reducing the MCP-1，MIF and TNF-αlevels in the rats.