血管生成素及其受体Tie2在白血病中的研究现状

董春娟，徐勇胜

天津市儿童医院呼吸科，天津 300074

血管新生是指在原有血管的基础上新血管高度有序形成的过程。研究发现白血病患者骨髓微血管密度增加，说明血管新生也参与了白血病的发生。血管新生受多种细胞因子的调控，其中血管生成素(Angiopioetin， Ang)及其受体Tie2(tyrosine kinase receptor with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domain-2)在肿瘤血管新生中具有调节血管稳定、成熟和重建的作用。本文就近年Ang/Tie2在白血病中的研究进展做一概述。

Ang及其受体Tie2是近年来发现的血管生成调节因子。Ang家族由血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)、血管生成素-3(Ang-3)、血管生成素-4(Ang-4)组成，与受体Tie2结合后参与血管新生。Ang-1主要由血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)和管周细胞分泌，广泛表达于全身各组织。Tie2为酪氨酸激酶受体，Ang-1与Tie2结合后引起酪氨酸激酶磷酸化，进而发挥Ang-1维持新生血管稳定，促进新生血管成熟的作用[1]。Ang-2 亦由VEC和管周细胞分泌，在血管静止区域几乎不表达，而在血管重建区(如胎儿肝脏、成人卵巢、子宫、肿瘤组织等)高表达。Ang-2是Ang-1的天然拮抗剂，能抑制Ang-1的功能，Ang-2 与Tie2结合后不能引起酪氨酸激酶磷酸化，从而导致血管退化[2]。另一方面，Ang-2能破坏VEC与细胞外基质的相互作用，使不稳定状态的VEC对生长因子的敏感性增加，从而加强了血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)等细胞因子的促血管生成作用。因此，在仅有Ang-2存在时，血管发生退化，血管数目减少，同时伴有VEC的凋亡和血管平滑肌细胞的断裂；在Ang-2与VEGF同时存在时，血管数目增加，VEC增生活跃，血管壁通透性增加[3]。然而在特定的组织微环境和实验条件下，Ang-2与Ang-1一样起Tie2激动剂的作用[4]。Ang-3为鼠源性血管生成素，Ang-4主要在肺内表达[5]。酪氨酸激酶受体Tie2表达于内皮细胞、部分造血干细胞、造血祖细胞及肿瘤细胞等多种细胞。Tie2在血管重建区和血管静止区域均存在，说明其在血管新生和新血管稳定中均发挥作用，且缺氧和炎症性细胞因子都能诱导Tie2在VEC中表达[6]。研究发现Ang/Tie2在多种实体瘤中均表达，并且与肿瘤的侵袭、预后等因素相关[3]。最近研究证实，Ang/Tie2在白血病中亦表达并且与白血病的细胞形态、免疫分型、核型及预后等因素相关。

Ang及其受体在白血病中的表达：Muller等[7]用半定量逆转录聚合酶链反应(semiquantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测了白血病细胞系和患者标本中Ang-1、Tie2的mRNA水平，6种髓系白血病细胞系中4种高表达Ang-1；与正常对照相比，11例急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AMl)患者标本中，9例高表达Ang-1，7例高表达Tie2；6例慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)患者标本中，4例高表达Ang-1，6例高表达Tie2；所有外周血原始细胞大于20%的患者标本中均能检测到Ang-1的表达，而5例完全缓解的髓系白血病，4例淋巴系白血病及正常对照均未检测到Ang-1及其受体的表达。zhang等应用RT-PCR方法检测60例AMl患者外周血单个核细胞Ang-2表达，发现Ang-2 mRNA表达水平明显高于正常对照组[8]。

Ang及其受体与白血病细胞形态、核型及免疫分型的关系：Watarai等[9]用RT-PCR检测了36例AMl患者Ang-1、Ang-2、Tie2的表达，其中27例患者表达Ang-1、12例表达Ang-2、15例表达Tie2；Tie2在FAB分型的M2、M4、M5中高表达，而在M1、M3中低表达；Ang-2在CD7(+)的AMl患者中较CD7(-)的AMl患者表达高，而其他免疫表型如CD34、CD19、CD13、CD33均不影响Ang及其受体的表达；Ang-2在伴t(8;21)的AMl患者中较不伴该染色体畸变的患者表达低。Riccioni等[10]检测了111例AMl患者Tie2蛋白的表达情况，Tie2表达于59%的病例，其中22%的病例Tie2表达明显增加；Tie2(+)的AMl患者大多表达单核细胞的膜标记如CD14、CD11b、CD36，以及巨噬细胞集落刺激因子受体(macrophage colony-stimulating factor recepter，M-CSFR)，FAB分型多为M4、M5a、M5b；Tie2(+)的AMl患者初诊白细胞数较Tie2(-)的患者明显升高，且fms样酪氨酸激酶3(fms-like tyrosine kinase 3，Flt-3)表达高，突变率高；伴有inv(16)染色体异常的AMl患者大部分高表达Tie2。最近Hatfield等[11]培养91例AMl患者的原始细胞，其中62例患者细胞培养上清中检测到Ang-1的表达，23例患者检测到Ang-2的表达，进一步研究发现，伴有核磷蛋白(nucleophosmin1，NPM1)突变的细胞Ang-1表达明显增加。综上所述，Ang及其受体在M4、M5中表达高，并且与初诊时高白细胞，t(8; 21)、inv(16)等核型异常，以及Flt-3、NPM1突变等相关。

Ang/Tie2在白血病中发挥作用的机制：Ang/Tie2在管新生中主要通过激活下游磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3-K)途径，活化丝氨酸-苏氨酸激酶Akt，发挥抗凋亡作用， 促进VEC生长[12]。Ang/Tie2在白血病中是否也是通过PI3-K途径发挥作用，不少学者对此进行了研究。Watarai等[9]研究发现CD7(+)AMl细胞高表达Ang-2，且在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells)中存活时间长，因此推测Ang-2通过旁分泌作用于内皮细胞上的受体，促进血管新生来进一步“饲养”白血病细胞。在白血病细胞培养液中，特别是Tie2(+)白血病细胞中能检测到Ang-1的表达，但白血病细胞与阻断Ang-1/Tie2途径的抑制剂共培养后，细胞凋亡增加，这表明Ang-1/Tie2能促进白血病细胞的生长[10]。Wakabayashi等[13]应用Tie2-Fc段抑制Ang与Tie2受体结合，观察Tie2-Fc对AMl细胞生长的影响。19例患者标本中，9例患者AMl细胞生长未受Tie2-Fc的抑制，被归为A组；10例患者AMl细胞生长明显受抑制，被归为B组。同样PI3-K抑制剂LY294002不能抑制A组AMl细胞生长，但能明显抑制B组AMl细胞生长，而且LY294002和Tie2-Fc对AMl细胞生长的抑制程度具有一致性。该结果也在细胞系中得到进一步证实，KG-1细胞的生长能被Tie2-Fc和LY294002抑制，而HL-60细胞的生长不受抑制。该实验说明，部分AMl细胞依赖Ang/Tie2生长，并且Ang/Tie2依赖下游的PI3-K途径，促进细胞生长，抑制凋亡。

Ang及其受体对白血病预后的意义：研究证实，多种临床或生物学因素如年龄、核型、Flt-3和NPM1等基因突变、对诱导治疗的反应等均影响AMl的预后[14]。近来Ang及其受体对白血病预后的影响引起了诸多研究者的兴趣。Loges等[15]用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)检测90例AMl患者外周血单个核细胞Ang-1、Ang-2、Tie2 和VEGF mRNA水平及其与预后的关系，多因素分析表明Ang-2及对诱导治疗的反应是总体生存率的独立预后因素，高表达Ang-2者预后好，尤其是对VEGF低表达的患者。Schliemann等[16]用免疫组织化学法检测AMl患者骨髓活检标本中Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白的表达，与正常对照相比，Ang-1表达无差别，Ang-2、Tie2表达增高；进一步研究表明Ang-2高表达组总体生存率更高，特别是在Ang-1低表达组，Ang-2对预后的影响更明显，而在Ang-1高表达组，Ang-2对预后的影响不明显。然而，Hou等[17]用qPCR检测126例AMl患者骨髓单个核细胞Ang-1、Ang-2、Tie2和VEGF的表达，并分析各因素对预后的影响，多因素分析显示Ang-2是总体生存率的独立不良预后因素，特别是在中危核型组Ang-2对预后的影响显著，而在低危和高危核型组则不明显；且Ang-2对预后的影响在Ang-1或Tie2低表达、VEGF高表达患者中有意义。最近Kümpers等[18]分析了循环中Ang-2水平对高危AMl患者异基因造血干细胞移植后预后的影响，移植前循环中Ang-2高的白血病患者异基因造血干细胞移植后无病生存率低，且移植前Ang-2水平是异于其他已知因素(如骨髓浸润程度，移植前化疗次数)的独立预后因素。Zhang等[8]应用RT-PCR方法检测AMl患者外周血单个核细胞Ang-1、Ang-2、Tie2和VEGF mRNA水平及其与预后的关系，发现Ang-2及是AMl患者总体生存率的独立不良预后因素，而Ang-1和Tie2对总体生存率无影响。同时Koenecke等[19]发现移植前AMl患者血清中可溶性Tie2及Ang-2的水平较正常对照明显增高，且可溶性Tie2为移植后复发的独立危险因素，特别是可溶性Tie2和Ang-2同时升高者总体生存率更低。Aref等[20]发现Ang-2高表达AMl患者总体生存率低，而Ang-2/Tie2比例是AMl患者独立不良预后因素。

上述几组实验结果截然相反，其原因一方面可能是患者样本存在差异，另一方面可能由于所用实验技术不同。Loges等用qPCR检测外周血原始细胞Ang/Tie2的表达，Schliemann等用免疫组织化学法检测骨髓活检标本，而Hou等用qPCR检测骨髓单个核细胞，Kümpers等用酶联免疫吸附反应(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清中的Ang-2。然而，从另一角度看相反的实验结果却有共同之处，Loges等和Hou等的实验结果说明Ang和VEGF相互作用的重要性。如果将患者标本分成VEGF高表达组和低表达组，Hou等的实验结果表明，在VEGF高表达组Ang-2是不良预后因素，而在VEGF低表达组Ang-2预后意义不显著；Loges等的结果显示，Ang-2和VEGF均高表达的患者比Ang-2高表达而VEGF低表达的患者预后差。由此可见，Ang-2和VEGF两种细胞因子同时作用时患者预后较差[8,21]。

慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是一组有着不同病程的异质性的疾病，多种预后因素决定CLL临床病程和转归，免疫球蛋白重链可变区基因无突变(unmutated immunoglobulin heavy chain variable region，unmutated IgVH)、ZAP-70(+)(70-kDa zeta-associated protein)或CD38(+)均是独立不良预后因素[22,23]。一些学者研究了Ang-2对CLL预后的意义，发现处于Binet分期B、C期的患者Ang-2表达高于A期患者，并且ZAP-70(+)CD38(+)的CLL患者比ZAP-70(-)CD38(-)的CLL患者高表达Ang-2[24]。另一些学者证实，Ang-2高表达的CLL患者临床分期较晚，CD38(+)和unmutated IgVH细胞百分比较高，不良预后核型较多见，无进展生存期较短[25]。Binet A期的CLL患者中30%表达Ang-2，Ang-2的表达与骨髓微血管密度有显著相关性；诊断时Ang-2高表达的患者疾病进展快，需要早期治疗，无进展生存率低[26-28]。这些研究表明，Ang-2不仅反映了CLL肿瘤负荷，也反映了肿瘤的恶性程度，Ang-2高表达的患者恶性程度更高，进展更快。

展望：Ang/Tie2在白血病中异常表达，并且与白血病的细胞形态、免疫分型、核型及预后等因素相关，是白血病治疗的潜在靶点。临床1、2期试验显示，沙利度胺和两种小分子酪氨酸激酶抑制剂(SU5416和SU11248)能明显降低原发和复发难治白血病患者的骨髓微血管密度[29-31]。而Ang-2选择性阻断剂能显著抑制鼠结肠癌标本的血管新生[32]。最近，针对Ang的重组Fc片段在进展期实体瘤中的临床1期评价工作也已完成(www.clinicaltrials.gov/ct/show/NCT00102830)。综上所述，研究Ang/tie2在白血病中的表达及其病理生理机制，将有利于白血病治疗的进展。

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