湖南湘潭县寸三莲真实性的分子鉴定

吕刚 ，魏林 ，梁志怀，马艳青 ，张屹

（1.中南大学研究生院隆平分院，长沙，410125；2.湖南省植物保护研究所；3.湖南省西瓜甜瓜研究所；4.湖南省蔬菜研究所）

子莲（Nelumbo nuciferaGaertn.）是我国的特色水生蔬菜之一，其果实——莲籽可供食用、药用，其花是中国十大名花之一，深受人们喜爱而广泛种植[1]。湖南子莲品种寸三莲因其品质优良在清道光、光绪期间作为贡莲，备受瞩目。寸三莲3颗莲籽正好1寸（3.3 cm）长，故称寸三莲，色白、营养，100 g莲籽的蛋白质含量比鸡蛋还高。湖南湘潭县为寸三莲的起源地，寸三莲一直为当地重要的经济作物，得到大面积推广种植。目前各寸三莲种植户一般都是自行留种进行种植，种植户之间存在多种寸三莲品系或株系，品种比较混乱，给湘莲市场和湘莲品牌带来了不利影响。因此很有必要对当前混乱的湘莲品种亲缘关系进行分子检测分析，从分子水平上探索不同寸三莲资源的遗传差异，并最终获得对寸三莲典型品系341及其亲缘关系很近的子莲品种具较好识别作用的鉴定体系。

SRAP标记，相关序列扩增多态性（sequencerelated amplified polymorphism，SRAP）是一种基于PCR的标记系统，由美国加州大学蔬菜作物系Li等[2]于2001年提出，又叫基于序列扩增多态性（sequence-based amplified polymorphism SBAP）[2]。该标记通过独特的引物设计对ORF（open reading frames）进行扩增，上游引物长 17 bp，5'端前 10个碱基为“填充”序列（filler sequence），无任何特异组成，接着为CCGG序列，它们组成核心序列及3'端3个选择性碱基，对外显子进行特异扩增；下游引物长18 bp，5'端前11个碱基为“填充”序列，紧接着是AATT，它们组成核心序列及3'端3个选择性碱基，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。该标记具有简便、稳定、产率高、便于克隆目标片段的特点，并已被应用于图谱构建、比较基因组学[3，4]和遗传多样性分析。

因此，以前期研究确定田间种植表现型优秀、编号为341号的寸三莲品种为典型品系，以寸三莲原种场栽种的湖南湘潭县内101份寸三莲种质资源和21份太空莲等子莲品种为对比材料，应用SRAP技术，对其鉴定体系进行了试验研究，初步研究结果如下。

1 材料与方法

1.1 子莲样品的采集

以湘莲寸三莲为主要研究对象，收集了包括典型品系341在内的湖南湘潭县寸三莲品种资源102份，其中排头乡29份、龙口乡16份、乌石镇14份、石鼓镇13份、白石镇10份、中路铺镇10份、茶恩寺镇6份、石潭坝镇4份。另外还采集了外地品种广昌莲和赣莲62号等外来引进品种21份作为对比材料。

1.2 子莲样品的DNA提取

取子莲幼嫩叶片，液氮研磨粉碎后提取DNA，具体方法：称取1 g样品液氮研磨至粉碎，转移至1.5 mL的离心管中，再加入600 μL经65℃预热过的2.5%的 CTAB，65℃水浴 1 h，每隔10 min颠倒混匀一次；加入体积比为 25∶24∶1的酚∶氯仿∶异戊醇 600 μL，充分混匀，冰浴 10 min 后，4℃、12 000 r/min平衡离心20 min；取上清液至另一干净的离心管中，加入500 μL冰冷的异丙醇，轻轻混匀，放入 4℃冰箱保存 30 min后，4℃、12 000 r/min平衡离心5 min；倒掉上清液，加入1 mL的无水乙醇清洗DNA，离心1 min，倒掉乙醇，晾干后加入50 μL ddH2O。提取结果用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测[5]。

1.3 引物筛选

为筛选出多态性好、扩增稳定的引物组合，利用田间表现型鉴定出寸三莲品种的典型品系 （编号为341号，来自于排头乡长山黄见德）进行SRAP标记技术用的共计225对引物的筛选。所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。反应体系为12.5 μL，其中ddH2O7.05μL，DNA模板2μL，buffer 1.25 μL，dNTPs 1.0 μL，上下游引物各 0.5 μL，Taq酶 0.2 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min，之后共35个循环 ：94℃ 变 性 20 s，54℃ 退 火20 s，72℃延伸 30 s。最后 72℃延伸 7 min。PCR 产物通过8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测进行引物的筛选。

1.4 寸三莲典型品系341分子标记的确定

利用筛选出的多态性好、扩增稳定的引物组合对所有样品进行PCR扩增，PCR反应体系和反应程序同1.3。PCR产物通过8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，寻找能检测出典型品系341的特异性标记。

2 结果与分析

2.1 子莲样品DNA的提取

应用1.2所述的方法，能获得较好的样品DNA，结果见图1。

图1 部分籽莲样品DNA提取结果电泳

表1 筛选出的引物序列

2.2 SRAP引物筛选

筛选出了16对多态性好、扩增稳定的引物 ME1+EM3；ME3+EM10；ME4+EM5；ME5+EM1；ME5+EM7；ME6+EM2；ME6+EM4；ME8+EM2；ME8+EM6；ME8+EM12；ME11+EM12；ME12+EM4；ME14+EM3；ME14+EM7；ME14+EM10；ME15+EM9，具体引物序列见表1。

2.3 获得典型品系341的特异性分子标记

利用筛选出的多态性较好引物组合进行SRAP分析。其中上游引物ME6（5'-3'TGAGTCCAAACCGGACA）加下游引物 EM2（5'-3'GACTGCGTACGAATTTGC）的引物组合对341号有特异性扩增,扩增条带长度在390 bp左右（图2，3）。部分样品来源如表2所示。试验结果还显示，该特异性分子标记除对典型品系341具有重复性很好的鉴别作用外，还对供试的123份样品中其他12份样品也扩增出了条带（样品来源见表3）。溯源这些样品在田中的表现型，发现它们的产量、花形、花色及对腐败病的抗性等都与典型品系341相近。

表2 部分供试样品来源

表3 具备341号相同特异性条带的样品

3 结论与讨论

SRAP技术也已被应用在莲的遗传研究上[6～8]。本试验利用SRAP技术，首先筛选得到了多组对寸三莲品种典型品系341扩增稳定、多态性好的引物组合，再将这些引物同其他101份样品比较，获得了ME6+EM2的特异性的分子标记引物，典型品系341扩增出一条约390 bp大小的特异性条带。由于寸三莲主要在湖南湘潭地区种植，具有较强的地域特性，品种之间遗传距离小，导致区分难度加大。本试验开发的ME6+EM2分子标记，获得了特异性较高的扩增片段，可以作为品种鉴定的辅助手段，经重复试验，扩增稳定、重复性好，可以区分亲缘关系较远的品种，较大限度地识别寸三莲的典型品系。但是，由于所获得的特异性片段为非主扩增带，难以识别亲缘关系很近的品种，当品种间亲缘关系较近时，识别难度加大。如在本试验中，在供试的123份样品中还有其他12份样品也扩增出了与典型品系341一致的特异性条带，而分析表明，这12份样品在田中的表现型都与341相近，这可能是由于这些材料与典型品系341有较近的亲缘关系所致。所以为稳定湘莲市场，打造湘莲品牌，分子手段可以作为一种辅助手段，但实际应用时，还应该考虑品种的来源并结合田间栽培的表现型进行鉴定。

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