萝卜抗黑腐病、黑斑病和根肿病育种相关基础研究

甘彩霞，袁伟玲，崔磊，王晴芳，於校青，邓晓辉

（湖北省农科院经济作物研究所，武汉，430070）

“十二五”期间湖北省农科院经作所在萝卜抗黑腐病、黑斑病和根肿病育种上开展了相关基础研究，为后续抗性资源的利用、抗性遗传规律的研究以及分子标记的开发进行了技术储备。

1 萝卜黑腐病抗病育种相关基础研究

1.1 萝卜主产区病原菌的分离鉴定

①柯赫氏法则回接验证 采集萝卜主产区黑腐病病样，采用稀释涂布分离法在NYGA平板培养基上分离培养病原菌。采用苗期活体喷雾接种和萝卜块离体涂抹接种2种方法回接病菌，叶片出现了水渍状“V”字形斑与田间症状相似，萝卜块出现黑腐症状，说明采集的菌株均为黑腐病病原菌，然后从中选择致病力强的菌株进行后续试验。

②16S rDNA序列分析与Biolog细菌自动鉴定系统测定 将测得的WHHF菌株的16S rDNA序列与GenBank中的核酸数据进行比对，选取同源性较高的序列。WHHF菌株16S rDNA序列与油菜黄单胞杆菌油菜致病变种Xanthomonas campestrispv.campestris（Pammel）Dowson同源性极高，达到了99%，进一步明确了WHHF菌株属于油菜黄单胞杆菌油菜致病变种。

应用Biolog细菌自动鉴定系统测定菌株，将结果经计算机处理后与数据库内已知的细菌比较，分析后进一步确认验证该菌株为油菜黄单胞杆菌[1]（Xanthomonas campestrispv.campestris）。

1.2 抗性种质筛选

萝卜黑腐病多从叶缘水孔或伤口侵入[2]，基于侵染发病条件设计可分为活体接种或离体接种。活体喷雾接种适于多份种质资源需要快速检测其苗期抗病，重复多、接种量大时采用；离体菌液注射接种适于少量试验材料且发病条件易于控制时采用，可为喷雾接种初筛材料后的补充，采用该接种方法要求发病条件更加均匀一致。

①苗期喷雾接种 基于萝卜黑腐病侵染为叶缘水孔侵入，采用苗期喷雾接种法，即在光照培养室内（25～30℃），选择浓度为 1.0×108cfu/mL 的细菌悬浮液采用喷雾法于萝卜5～6片叶期接种，保湿24 h，7 d后调查病情，评价萝卜品种对黑腐病的抗性[3]。

喷雾法分级标准：0级：无病；0.1级：叶上有一个小斑；0.5级：叶上有几个病斑，或一个较大的病斑；1级：叶上发病区占叶面积的 1/4；2级：叶上发病区占叶面积的 1/2；3级：叶上发病区占叶面积的3/4；4级：病区占叶面积 3/4以上至全叶。

按病情分级调查后，计算病情指数，根据发病程度对抗病性分级。免疫（I）：病情指数=0；高抗 （HR）：0＜病情指数≤10； 抗病 （R）：10＜病情指数≤20； 中抗（MR）：20＜病情指数≤40；感病（S）：病情指数＞40。

利用该鉴定方法，对萝卜42份种质资源进行了抗病性鉴定和分级，其中，有6份材料表现为抗病，18份表现为抗性中等，其余18份均表现为不抗病。

②萝卜块离体接种 基于萝卜黑腐病侵染可从伤口侵入，且萝卜为根菜类作物，采用萝卜块离体接种方法，即在萝卜块中间用移液枪加上1×108cfu/mL菌液，盖玻片将菌液均匀涂满萝卜块，接种后48 h调查病情指数。

病情指数分级标准：0级：无症状；1级：在萝卜块上有水渍变黄症状；3级：病斑变成黄褐色并伴随腐烂症状；5级：病斑腐烂面积扩大并深入萝卜块中；7级：病斑变成黑褐色；9级：萝卜块完全黑腐萎蔫。

按病情分级调查后，计算病情指数，根据发病程度对抗病性分级[1]。免疫（I）：病情指数=0；高抗（HR）：0＜病情指数≤10；抗病 （R）：10＜病情指数≤20；中抗（MR）：20＜病情指数≤40；感病（S）：病情指数＞40。

由表1可见，13份高代自交系没有抗病材料，中抗材料有2份，其他均为感病和高感材料。

2 萝卜黑斑病抗病育种相关基础研究

2.1 萝卜主产区病原菌的分离鉴定

采集萝卜主产区黑斑病病样，分离病健交接部位在PDA平板培养基上培养，显微镜下挑取单孢进行分离培养。对比参照十字花科链格孢形态确定致病菌为萝卜链格孢，采用苗期活体喷雾接种和萝卜叶片离体菌饼接种2种方法回接病菌，活体叶片出现了轮纹状黑斑与田间症状相似，萝卜块出现侵染症状[4]，说明采集的菌株均为黑斑病病原菌，然后选择致病力强且产孢量多的菌株WHHB1进行后续试验。

2.2 黑斑病病原菌发病条件确定研究

研究结果表明，豆芽培养基是产孢最佳的培养基；菌株在15℃培养时孢子萌发率最高，在0℃时萌发率最低；在第4～7天菌丝生长较快，第10～13天菌丝生长较慢；菌株在日光灯照射下培养2 h产孢量增多，照射培养24 h产孢量减少。该结论对生产中黑斑病的发病侵染控制有一定的参考作用，生产田间若有黑斑病发生，而此时温度在15℃左右，则侵染的第4～7天是发病最快的时间段，应在此期对黑斑病进行预防和控制，效果较佳[5]。

2.3 抗性种质筛选

选择30 d苗龄、健壮且长势一致的萝卜植株，取其第3、4片真叶，选择浓度为1.0×105个孢子/mL的菌株孢子悬浮液喷雾接种于离体叶片，在室内温度25～30℃，保湿5 d后调查病情指数。

按0～9级标准进行发病程度调查。0级：无症状；1级：接种叶生褐色小点，无褪绿斑；3级：接种叶生3 mm以下的褪绿斑，无霉层；5级：接种叶生3 mm以上的褪绿斑，有极少霉层，病斑不连成片；7级：接种叶生5 mm以上的褪绿斑，有较多的霉层，病斑连成片；9级：接种叶病斑连成片，大面积枯死，霉层明显。

抗病性分级标准参照李树德[6]的方法：免疫（I）：病情指数 0；高抗（HR）：0.1≤病情指数≤11.11；抗病 （R）：11.12≤ 病 情 指 数 ≤33.33； 中 抗 （MR）：33.34≤病情指数≤55.55；感病（S）：55.56≤病情指数≤77.77；高感（HS）：77.78 以上。

由表1可见，13份高代自交系有1份抗病材料，6份中抗材料，其他6份均为感病材料。

3 萝卜根肿病抗病育种相关基础研究

病原菌为沈阳农业大学提供的根肿病4号生理小种。所有材料均用根肿病4号生理小种接种，子叶期至1叶期以2×107个孢子/mL的浓度灌根接种幼苗，接种后第6周调查发病情况。

萝卜抗根肿病病情指数分级标准如下：0级：无根瘤；1级；须根上有几个零散的小根瘤；3级：有较大根瘤，且症状明显；5级：主要根系上有较多聚集根瘤。

由表2可见，后续试验初步定为露头青、喜诺青为感病备选材料；白将军、217早太郎、石庄白、美侬为抗病备选材料。

另利用灌根法对种质资源及59份品种筛选，其中有31份材料抗病，可为后续抗性资源作储备。

表1 13份高代自交系抗WHHF和抗WHHB1菌株接种后48 h病情指数

4 讨论与结论

①在萝卜抗黑腐病筛选方法上，针对喷雾接种、剪叶接种、叶柄注射接种和萝卜块涂抹接种均进行了试验，每种方法各有所长，也各有缺陷。喷雾接种最接近大田自然发病条件，但若菌原正好从水孔侵入则发病，未侵入时不能代表材料不会感染发病，发病不均匀，需多次反复接种，尽可能使病原菌侵染均匀一致；剪叶接种因剪叶截面积小，菌种浓度控制不均匀，也会导致发病不均匀；叶柄注射接种和萝卜块涂抹接种因取材部位不同，抗病性有不一致现象，考虑到萝卜属于根菜类，进行萝卜块接种更接近产品器官[1]。研究重点采用萝卜块离体涂抹接种进行抗性筛选，13份高代自交系筛选结果为没有抗病材料，有2份中抗材料，其他为感病和高感材料。结合田间进行抗性种质筛选，由于大田环境因素难以控制，接种后发病不均匀，且多年多次接种结果均不一致，不建议采用此方法进行接种。

②在萝卜抗黑斑病筛选方法上，针对喷雾活体接种、喷雾离体叶片接种和菌饼离体接种均进行了试验，每种方法各有所长，也各有缺陷。喷雾接种最接近大田自然发病条件，且活体存活期长，利于更持久的侵染观察，但接种需反复多次，避免接种不均匀而导致发病不均匀，尽可能使病原菌侵染均匀一致；喷雾离体叶片接种便于控制环境温湿度，且接种鉴定周期短，节省鉴定空间，取样后种质材料可以继续生长进行田间其他试验或者留种；菌饼离体接种与离体叶片喷雾接种类似，便于控制环境温湿度，节省空间，但与孢子接种不同，菌饼接种更易因菌株产生毒素而侵染离体叶片，需要更多的试验进行分析。研究重点采用喷雾离体叶片接种进行抗性筛选，13份高代自交系筛选结果为有1份抗病材料、6份中抗材料、6份为感病材料。本研究结合田间进行抗性种质筛选，由于大田环境因素难以控制，接种后发病不均匀，且多年多次接种结果均不一致，不采用此方法进行接种。

表2 13份高代自交系抗根肿病筛选结果

③十字花科根肿病相关研究很多，研究当中直接利用已知的4号生理小种进行筛选，针对接种方法的筛选前人开展了相关研究，在此不再赘述，研究当中采用的灌根法进行接种，获得的抗、感备选材料进行群体构建、分子标记的开发。

④研究筛选的抗、感材料，启动了遗传群体的构建工作，结合表型验证进行抗性位点QTL定位，筛选多态性标记，为种质资源的分子标记辅助育种和种质资源创新打下基础。

[1]甘彩霞，邓晓辉，袁伟玲，等.武汉萝卜主产区十字花科黑腐病病原菌鉴定及萝卜抗性种质筛选[C]//中国园艺学会十字花科蔬菜分会第十二届学术研讨会论文集，2014：148-153.

[2]吕佩珂，苏慧兰，高振江，等.中国现代蔬菜病虫原色图鉴[M].内蒙古：远方出版社，2008：523.

[3]甘彩霞，何云启，崔磊，等.萝卜黑腐病苗期抗病性鉴定方法的研究[J].湖北农业科学，2010，49（12）：3 057-3 060.

[4]甘彩霞，祝花，崔磊，等.萝卜黑斑病苗期室内抗病性鉴定方法研究[J].湖北农业科学，2013，52（19）：4 645-4 647.

[5]甘彩霞，袁伟玲，王晴芳，等.萝卜黑斑病菌JZHB_7菌株的生物学特性及培养基的筛选[J].湖北农业科学，2014，53（10）：2 312-2 315.

[6]李树德.中国主要蔬菜抗病育种进展[M].北京：科学出版社，1995.