Txt5腺病毒载体构建及其在心肌细胞中的表达

彭 浩，陈 宇，李佑锋，朱 旋，周作琼，吴秀山，范雄伟，李永青

(湖南师范大学 心脏发育研究中心 蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室，湖南 长沙 410081)

Txt5位于2号染色体短臂11区2带，长度为3239 bp，编码蛋白含391个氨基酸，从N 端开始依次为LisH、CTLH、CRA 结构域.LisH 结构域被发现存在于很多病症相关基因的产物之中[1-2].已经有研究证明，Txt5可能参与了MAPK 途径对细胞生命活动的调控[3].RT-PCR 分析显示这一基因在人类早期胚胎的多个组织中有表达，在心脏、肝和肾中表达水平较强.腺病毒转染能够使外源基因在原代细胞中高效表达[4]，为了进一步研究Txt5 基因的功能，本文利用Ad-Easy 腺病毒系统研制了小鼠Txt5 基因的过表达腺病毒[5]，为后续研究Txt5表达及生物学功能提供实验依据.

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 生物材料

解剖小鼠取心脏提取mRNA，反转录获得cDNAs.连接载体pMD18-T 购买于Takara.穿梭载体pAdTrack-CMV、BJ5183 菌株以及HEK293 A 细胞均为实验室所保存.

1.1.2 所用主要试剂

PmeΙ、Pac Ι 内切酶均购买于NEB公司，T4 DNA连接酶、Sal Ι和Hind III 限制性内切酶买于Takara公司;胶回收纯化试剂盒购买于康维世纪公司，逆转录试剂盒购买于Thermo fisher公司，小量快速质粒提取试剂盒购买于康维世纪公司;兔源HA 一抗为美国圣克鲁斯公司生产;Lipofectamine 2000 试剂购买于英潍捷基公司;高糖DMEM 培养基、F12 培养基和胎牛血清购买于Hyclone公司.

1.2 方法

1.2.1 穿梭质粒pAdTtrack-CMV-Txt5的构建

根据NCBI 数据库，设计特异引物如下:5'-AGATCTATGGATCAGTGCGTGACGGTG-3'和5'-AAGCTTTCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTA GAAAAATATCTGTTTGGCATCTCCT-3'.

PCR 扩增目标片段经测序正确后连接至pMD-18 T 载体，转化大肠杆菌感受态细胞，卡那霉素筛选阳性克隆.

1.2.2 pAd-Txt5的获得

质粒小提试剂盒提取穿梭质粒pAdTrackCMV-Txt5，用Pme Ι 酶37℃酶切过夜线性化，纯化回收酶切产物.将产物转化进入BJ5183 感受态，通过其内的重组组件发生同源重组，涂布于卡那抗性平板上筛选.质粒小提试剂盒提取重组质粒，37℃Pac Ι 酶切过夜线性化，2%凝胶电泳观察是否有两条带，利用酚氯仿法抽提DNA，保存于-20℃.

1.2.3 线性化pAd-Txt5 转染HEK 293 A 细胞

复苏冻存于液氮中的HEK 293A 细胞，培养于10 cm 培养皿中.当细胞融合率达80%左右后，取线性化的pAd-Txt5 4 μg，通过Lipofectamine 2000 转染HEK 293 A 细胞.5 h 后换含10%胎牛血清的培养液10 ml，转染12 h 后通过荧光显微镜观察HEK 293 A 细胞绿色荧光情况，之后每隔12 或24 h 观察荧光并拍照.在第10 d 左右，会有大团细胞漂浮.吸打下细胞，将细胞液用液氮反复冻融2～3次，2 000 r/min，10 min.上清即病毒粗提液，EP 管分装于-80℃保存.

1.2.4 Ad-Txt5 病毒颗粒的扩增

10 cm 皿中293 A 细胞密度约达80%的时候，开始转染:取0.4 ml 病毒粗提液溶液加到皿中，在第3 d左右，会有大团细胞漂浮.将细胞吸打下来，将细胞液用液氮反复冻融2～3次，2 000 r/min，10 min.上清即病毒粗提液，EP 管分装于-80℃保存.

1.2.5 分离和培养原代心肌细胞

解剖出生一或两天SD 大鼠，冰上剪取心脏的心室心尖，PBS 中洗去血液.接着剪碎组织，先后于0.06%胰酶中和II 型胶原酶中进行消化.然后将消化完全后的液体加入10 mL 含10% FBS 培养基中终止消化，混匀，2 000 r/min，10 min，倒去上清.加5 mL含10% FBS的培养基再洗一次，2 000 r/min，5 min.倒去上清，用20 mL 含10% FBS和0.067 mg/mL 浓度Brdu的DMEM-F12 培养液混匀细胞，200 目筛过滤细胞液至两个10 cm 皿中.差速贴壁2 h 后，将悬浮细胞液体吸取到10 cm 皿中，2 d 后更换培养基.

1.2.6 免疫印迹鉴定

将Ad-Txt5 重组腺病毒和Ad-GFP 空载腺病毒感染心肌细胞，72 h 之后可见到绿色荧光，收取心肌细胞，提RNA 及蛋白.将蛋白进行电泳:配置电泳胶，加入等体积的蛋白样品40 μg，120 V 电泳20 min;湿转:100 V，90 min 将蛋白转到PVDF 膜上，15 V，1 h.加封闭液(TBST 加5%脱脂奶粉)，37℃封闭1～2 h;用TBST 洗去牛奶的颜色;兔源HA 一抗孵育，4℃过夜;TBST 溶液洗膜，3次，每次5 min，然后进行二抗的孵育，加入二抗，室温1 h;TBST 溶液再次洗膜3次，每次10 min;加入ECL 系统显色，压片，洗膜，观察结果.

1.2.7 RT-PCR

按mRNA Selective PCR Kit 试剂盒说明书取适量的RNA 进行逆转录.利用cDNA为模板，进行一般的PCR实验，反应程序:95℃，预变性2 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环;72℃延伸8 min.4℃保存，通过凝胶电泳来分析PCR 结果.

RT-GAPDH-S:5'AGCCCAGAACATCATCCCT3'

RT-GAPDH-A:5'GGTCCTCAGTGTAGCCCAAG3'

2 结果分析

2.1 pAd-Txt5 质粒的获得与鉴定

将pMD18-T-Txt5 利用Sal Ι和Hind III 限制性内切酶进行双酶切，纯化回收目的片段连接于同样双酶切后的穿梭载体pAdtrack-CMV 上，接着进行转化，提取出穿梭质粒pAdTrack-CMV-Txt5.再次Sal Ι和Hind III 限制性内切酶双酶切穿梭质粒进行鉴定，1.8%琼脂糖凝胶电泳结果有2条带，上方条带约为9 200 bp，下方条带约为1 000 bp，证明穿梭质粒构建成功(图1A).将重组完成后的腺病毒质粒用Pac Ι 酶切后进行1.8%琼脂糖凝胶电泳结果有2条带，上方条带约为34 kb，下方条带约为4 kb 亮带，说明腺病毒质粒pAd-Txt5 成功获得(图1B).

2.2 腺病毒颗粒的获得

腺病毒质粒pAd-Txt5 线性化之后转染HEK 293A细胞，24 h 后可见到绿色荧光(GFP)，之后荧光逐渐增多，48 h 时荧光大量出现(图2)，12 d 左右，细胞大团飘起，移液器将细胞吸打下来，反复冻融获得病毒溶液，过滤后再次感染293 A 细胞，12 h 后依然可以看到绿色荧光.

2.3 Txt5 过表达腺病毒在心肌细胞中的表达

图1 穿梭质粒pAdTrack－CMV－Txt5和腺病毒质粒pAd－Txt5酶切后电泳图

图2 线性化pAd－Txt5转染48 h后观察结果(×20)

Txt5 基因通过IRES 序列与腺病毒载体基本骨架中的GFP 序列共表达，感染了腺病毒的心肌细胞就会出现绿色荧光.Txt5 过表达腺病毒感染SD 大鼠原代心肌细胞，48 h 后出现比较强的绿色荧光.病毒没有使心肌细胞出现明显的死亡现象且形态完整，可见毒性还算安全(图4).

为检测腺病毒是否能发挥应有的作用，将过滤后的病毒粗提液感染SD 大鼠原代心肌细胞.提取RNA和蛋白，然后进行RT-PCR，另外用兔HA 一抗和羊抗兔二抗做Western blot 检测.RT-PCR 显示，Txt5表达上调;Western blot的结果显示，感染Txt5 过表达腺病毒的心肌细胞中检测到与Txt5 融合表达的HA，而感染空载腺病毒Ad-GFP的对照组中未检测到该条带(图4)，说明该腺病毒成功介导Txt5 在SD 大鼠原代心肌细胞中的表达.

图3 Txt5过表达腺病毒感染原代心肌细胞观察结果

图4 RT－RCR与免疫印迹法检测腺病毒效果

3 讨论

研究发现许多神经系统疾病相关基因的产物都具有LisH 结构域[6].这一结构域可能参与调节微管的动力，参与二聚化或与微管胞质动力蛋白重链相结合.Txt5 蛋白包含有LisH 结构域，这给我们启示，是否Txt5和MAPK 信号通路有关[7].MAPK是一类重要的细胞信号转导激酶，调节多种激素、神经递质、细胞因子、生长因子对细胞生理活动的作用，该激酶作用底物多为例如Elk21、AP21[8]等的转录因子.

腺病毒在研究基因功能和治疗方面的应用具有以下优势:1)比较广的宿主范围，可以感染原代心肌细胞;2)能有效进行增殖，滴度较高，易于培养;3)基本上不插入宿主的基因组，不造突变[9-10].本文所用的腺病毒载体基本骨架中便含有GFP 序列，通过IRES 序列Txt5 基因与GFP 共表达，绿色荧光就会出现在感染了腺病毒的心肌细胞，视觉上就能判定感染效率.而RT-PCR 证明mTxt5 水平的上调，western blot发现HA表达，说明腺病毒效果良好，符合实验要求.

本文研制小鼠Txt5 过表达腺病毒的操作简单，周期较短，并且获得的腺病毒滴度较高，毒性不强，能满足体外实验的要求.而现今市面上检测Txt5的抗体比较少，本文研究设计中将Txt5 与HA 标签融合表达，从而可以通过常用的HA 对应抗体检测Txt5表达，给Txt5表达水平和位置的研究带来了极大的帮助.

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