石油烃降解菌的分离及在含油污泥中的应用

姚力芬1 李 丹1 陈丽华2 李广彬1 孙盼盼1 李佳酿3

（1．西北民族大学 化工学院，甘肃 兰州，730030；2．西北民族大学 实验中心，甘肃 兰州，730030；3．西北民族大学 电气工程学院，甘肃 兰州，730030）

近年来，石油污染的环境污染问题已越来越引起人们的广泛关注，在治理石油污染的方法中，生物修复法因其独特的优势受到广泛关注[1]。筛选出高效降解石油烃降解菌是生物修复的必然，目前有关石油降解菌方面的研究报道较多[2-3]。本文从甘肃陇东长庆油田中取得含油污泥，从中分离筛选得到六株降解石油烃菌株，并将其制得混合菌剂，同时进行了混合菌剂处理含油污泥的小试实验，为以后的实际应用奠定基础。

1 实验材料

1.1 含油污泥

试验所用油泥采自甘肃陇东油区。油泥的TPH含量为50g/kg，含水率为25%，pH为7.82。

2 实验方法

2.1 菌株分离

根据雒晓芳[4]等人的分离方法，取土样2.5g，加入到有200mL无机盐培养基的三角瓶中，在30℃，120r/min的恒温摇床上进行振荡培养7d，移取一定量的富集培养液接入新鲜降油培养基中，在相同条件下培养7d，相同操作共重复3次，经过3个周期的驯化后，在无菌条件下，用接种环蘸取驯化培养液，在降油培养基的平板上划线后，平板倒置于37℃恒温培养箱中培养24～72h，然后将代表性较好的菌落在降油培养基平板上反复划线纯化得到单一菌落，再将纯化的菌株接种至斜面保存培养基上培养后，保存于4℃冰箱中，待用。

2.2 菌株的鉴定

（1）常规鉴定：参照《微生物学实验》[5]，对筛选得到的六株菌株进行了菌落特征及菌体形态特征观察。

（2）生理生化鉴定：参照《常见细菌系统鉴定手册》[6]首先将筛选出来的六株菌进行复活，在无菌条件下，分别各挑取少量菌加入生化管中，密封，放入35℃恒温培养箱中培养24h后观察现象，平行做两组实验。

2.3 混合菌剂的发酵

2.3.1 菌剂的复活

将营养琼脂培养基配制好后，分装于试管中，每支试管约4-5mL，后将所有所需仪器高压灭菌，灭菌条件：121℃，20min，50℃保存。随后在超净台上进行接种，接种完后在恒温培养箱37℃培养24h，保存进行下一步工作。

2.3.2 一次扩培

将营养肉汤培养基配制好后，分装于三角瓶中，每个三角瓶约10mL，后将所有所需仪器高压灭菌，灭菌条件：121℃，20min，50℃保存。随后在超净台上进行接种，接种完后在恒温摇床培养箱37℃培养24h，保存进行下一步工作。

2.3.3 发酵

做好发酵罐的灭菌工作，然后进行接种，即倒入由a1、a2、a3、a4、a5、a6这六株菌（前三株所占体积百分数为50%，后三株为50%）按体积比为1:1:1:1:1:1配成菌悬液。

2.4 生长曲线的测定

按照文献[5]，对于在发酵罐中进行发酵的混合菌剂，每三小时取样一次，冷却后放入冰箱，48h后统一用752型紫外可见分光光度计测定其OD值。

2.5 TPH降解率的测定

根据参考文献[7]，土壤中石油类物质的测定采用紫外分光光度法。采用索式提取法提取土壤中石油类物质，利用紫外分光光度计测出相对应的吸光度，计算每千克干土中石油类物质含量，进而计算出石油类物质降解率 w：

其中w1： 为第1天土壤中石油类物质含量，mg/kg；mi为第i天土壤中石油类物质含量，mg/kg。紫外分光光度法测得原油的标准方程为：

其中：相关系数R2为0.5591。

为方便计算，将其转变为250 mL样品中所含的石油类总量和吸光度之间的关系式为：

其中：D为用250mL石油醚萃取含油土样得到萃取液的有效吸光度，无量纲；M为样品所含石油类污染物总量，mg。

2.6 微生物计数法

根据参考文献[8]土壤中微生物数量测定采用平板菌落计数法。

2.7 实验设计

本实验的调节剂选择的是容易取材的玉米秸秆，玉米秸秆提前粉碎备用，有机肥选用的是风干牛粪（C/N比为26，速效氮含量为1.7%），并按照油泥（湿重）与玉米秸秆的比例为98：2，油泥（湿重）与有机肥的比例为3：80的，含水率为50%来混合材料。

实验设计两个处理，实验组和对照组，两个处理均在室内同一条件下进行，底层铺上防渗塑料布，将所有物料倒在塑料布上，搅拌均匀，堆置起来。同时在两个堆体里加入发酵菌剂。上面覆盖塑料薄膜，以保温和保湿。中间插入通气管，通气管上每隔10cm打一个直径为1cm的孔，通气管外接通风设备，以在发酵过程中控制氧含量。在堆体上分别设置四个监测点，测量堆体温度，并动态监测堆肥过程中堆体的PH、温度等。当堆体的温度经历了升温，高温，降温三个阶段，并在温度降低至40℃左右时，向实验组堆体里按照5%的比例加入混合降油菌剂，25天时补加一次降油菌剂。对照组不添加菌剂。每7天采样，测定实验组和对照组微生物数量、脱氢酶活性及降油率的变化。

3 结果与讨论

3.1 菌株的鉴定

3.1.1 常规鉴定

对筛选得到的六株菌株进行了菌落特征及菌体形态特征观察，以下是各菌株的革兰氏染色和简单染色的效果图示。

镜检结果如下图1及表1所示：

表1 菌落的形状、质地、颜色及形态

3.1.2 生理生化测试

首先将筛选出来的六株菌进行生理生化实验，实验结果如下表2所示。

表2 生理生化试验鉴定结果

符号说明：“+”表示该项反应结果为阳性；“-”表示该项反应结果为阴性。

3.1.3 菌种鉴定结果

根据镜检和生理生化试验结果对照，得到以下结果如表3所示。

表3 常规鉴定实验结果

3.2 混合菌剂生长曲线的测定

根据图2可知，混合菌在发酵开始时由于刚刚进入新的环境，开始时的0~3h菌体处于生长迟缓期，3~21h时间段内菌体迅速生长，处于对数生长期，21h时菌体吸光度值达到最大值为。21h后菌体生长趋势开始进入稳定期，所以发酵菌剂时间选定为24h。

图2 混合菌剂生长曲线

3.3 微生物数量与TPH降解率的变化关系

控制其他影响条件基本相同，如温度、酸度、碱度、电导率、C/N、堆体的通气情况，均在微生物的最适范围子内。在不考虑其他变量的情况下，以是否加入石油烃降解菌剂作为唯一变量，讨论对照组和实验组微生物数量与降解幅度的关系。

由图3可知，微生物的数量与降解幅度在总体上基本呈相关关系，因微生物数量较多时，石油烃类化合物被大量分解，降解幅度较大。堆肥0天时，在实验组加入发酵菌剂和石油烃复合降解菌剂。此时，堆体的细菌数较多（约155×107个/g），微生物处于迟滞期，开始适应环境，不能适应环境的微生物会死亡，数量稍有降低。适应环境的微生物开始利用堆体中的有机物合成自身的细胞结构，迟滞末期，细胞个体变大，开始分裂。此时，细菌数虽稍有下降，但微生物数量仍较高，微生物利用石油作为能源进行新陈代谢，堆体中的石油烃类化合物被分解，降解幅度较大（约12%）。从第5天到第17天，微生物数量增长较快，达到最大340*107个/g，此时，微生物处于对数期，细菌利用堆体中的营养物质合成细胞结构大量繁殖，分解堆体中复杂有机物为较简单的有机物。因堆体为牛粪，纤维素含量较高，有机质含量较低，一次发酵菌剂主要是分解纤维素为较简单的糖类，利于降油菌剂分解。此时，堆体中的石油烃类化合物被微生物大量分解，降解幅度达到最大（35%左右）。

图3 微生物数量与TPH降解率的关系

从第17天到24天，细菌数量开始下降，细菌开始进入稳定期，营养物质称为主要的限制因素。此时，能被一次发酵菌剂降解的纤维素已基本被分解，其他营养物质含量也较低，细菌所需营养物质不够，停止生长分裂，细胞内的有害代谢产物开始积累；当进入衰亡期时，细菌所需营养物质已消耗殆尽，细菌开始进入内源消耗，细胞内的有害代谢产物大量积累，影响细菌的生理活动，此时细菌开始死亡，微生物数量下降达到最低（约150×107个/g）。当微生物数量下降时，细菌的降解幅度开始下降，微生物数量达到最低时，降解幅度为负（约-12%），说明含油量相比上次增加，当微生物死亡时，部分石油烃类残存在微生物残体内，并未被分解，或是细菌的代谢物中含有短链的脂肪烃类物质，所以含油量增高，降解幅度为负。

从37天开始，对照组加入二次降解菌剂（六株高效降解石油烃类的复合菌剂），微生物数量又开始大幅度增加（达到400*107个/g），大量利用石油烃类化合物合成细胞自身结构，降解幅度达到随之增加（达到18%）。此后，微生物数量开始逐渐降低趋于稳定，并逐步接近土壤本底值，降解幅度也趋于稳定。

对照组采用未加入降解菌剂的含油污泥和牛粪的堆肥实验，控制所有变量与实验组保持相同，由图3可知，在堆体开始发酵时，堆体内的微生物也经历适应期，对数期，稳定期和衰亡期，数量稍有变化，但由于对牛粪中的纤维素利用率较低，造成营养不足，难以大量降解石油烃类化合物，降解幅度几乎不变（维持在4%左右）。

4 结论

本研究从被长期被原油污染污染的土壤中分离筛选方法筛选出6种降油菌（a1~a6），并通过常规鉴定和生理生化试验，得到a1、a2、a3均为芽孢杆菌，a4、a6均为假单胞菌，a5为不动杆菌。通过细菌的复活，一次扩培，发酵操作，制得混合菌剂。

在实验室中进行微生物修复石油污染土壤的小试实验，结果表明，当土壤中石油含量为50g/kg时，加入混合菌剂的石油降解率比没有加菌剂的降解效率高，添加5%菌剂81d的降解率为90.20%，均大于对照组（只添加有机肥）的降解率31.10%，说明了该混合菌剂具有应用于实际石油污染土壤生物修复的潜力。

[1] 商雪娇,李思,张金辉.生物法处理含油污泥的研究进展[J].当代化工，2014，43（4）：622-624.

[2] 刘鹏,李大平,王晓梅,等.石油污染土壤的生物修复技术研究[J].化工环保，2006，26（2）：91-94．

[3] Belhaj A,Desnoues N,Elmer ich C.Alkane biodegradation in Pseudomonas aeruginosa strains isolated from a polluted zone:Identification of alkB and alkB-related genes[J].Res Microbiol，2002，153（6）：339-344.

[4] 雒晓芳,陈丽华,王冬梅,等.两株降油菌株的分离及其降油特性[J].中国酿造，2012，31（10）：72-74.

[5] 沈萍,陈向东.微生物学实验(第4版)[M].北京:高等教育出版社,2007.

[6] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社，2001.

[7] 陈丽华,马金珠,雒晓芳,等.添加混合菌剂对石油污染土壤的降解[J].中南大学学报(自然科学版)，2012，43（11）：4581-4589.

[8] 李洪梅,郜玉环,江丽华,等.不同浓度石油烃对油菜产量、土壤中石油烃残留量及土壤微生物的影响.中国农学通报，2010.26（17）：382-385．