国产盐酸特比萘芬对皮肤癣菌的体外抗菌活性研究

谈鑫 潘炜华 邓淑文 郭芸 雷文知 张超 周兆婧 方文捷 闻轶旸 沈帅帅 朱双 姚志荣 郑捷 邓丹琪 廖万清

（1.昆明医科大学第二附属医院皮肤科，昆明650101；2.上海长征医院皮肤病与真菌病研究所上海市医学真菌重点分子生物学实验室，上海200003；3.上海同济医院皮肤科，上海200065；4.上海新华医院皮肤科，上海200093；5.上海瑞金医院皮肤科，上海200025）

国产盐酸特比萘芬对皮肤癣菌的体外抗菌活性研究

谈鑫1潘炜华2邓淑文2郭芸1雷文知2张超2周兆婧2方文捷2闻轶旸3沈帅帅3朱双2姚志荣4郑捷5邓丹琪1廖万清2

（1.昆明医科大学第二附属医院皮肤科，昆明650101；2.上海长征医院皮肤病与真菌病研究所上海市医学真菌重点分子生物学实验室，上海200003；3.上海同济医院皮肤科，上海200065；4.上海新华医院皮肤科，上海200093；5.上海瑞金医院皮肤科，上海200025）

目的 研究探讨国产盐酸特比萘芬对皮肤癣菌的三个属和角层癣菌的体外抗菌活性。方法 应用美国国家临床和实验室标准研究所（CLSI）的M38⁃A2方案。菌悬液终浓度为（0.4～5）×104CFU／mL，孵育温度30℃，培养时间7 d。最低抑菌浓度（MIC）的判定标准为，在显微镜下观察，与阳性对照孔对比，100%生长抑制的最低浓度。最低有效浓度（MEC）的判定标准为在显微镜下观察，与阳性生长对照孔比较，50%以上生长抑制。结果 特比萘芬对138株暗色真菌最低有效浓度（MEC），MEC范围0.008～0.125 μg／mL，MIC范围0.008～0.25 μg／mL。国产盐酸特比萘芬的抗真菌效果与进口特比萘芬的抗真菌效果无显著差异（P＞0.05）。结论 国产盐酸特比萘芬对皮肤癣菌体外抗菌活性较高，可作为治疗浅部真菌病的有效药物之一。

国产盐酸特比萘芬；皮肤癣菌；体外；抗菌活性

［Chin J Mycol，2015，10（1）：22⁃24］

浅部真菌病是由皮肤癣菌、病原酵母菌等致病真菌或条件致病真菌感染人体皮肤、毛发和甲板等浅表组织而引起的一组疾病。随着广谱抗生素、糖皮质激素的广泛应用，以及人员流动、环境变化，浅部真菌病发病率呈日益上升的趋势，严重影响人类健康及生活。临床上，及时明确致病菌种，再根据药敏实验结果给予有效的抗真菌治疗，是浅部真菌病最为合理的诊治途径。目前发现的可使人类浅部组织感染的致病真菌已逾百种，盐酸特比萘芬是强效抗真菌药物，具有强效杀真菌、减少复发，缩短疗程，抗炎、亲脂等特点。本课题旨在验证国产盐酸盐酸特比萘芬对不同菌株的体外药敏性特征，从多中心抽取样本检验其活性。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

共收集上海长征医院、上海瑞金医院、上海新华医院、上海长海医院、上海华山医院、昆明医科大学第二附属医院、新疆医学院第一附属医院等六家医院的浅部真菌临床分离株138株。其中红色毛癣菌70株（50.7%），其他毛癣菌23株（包括紫色毛癣菌、疣状毛癣菌、断发毛癣菌、西非毛癣菌、指间毛癣菌、许兰毛癣菌6种，占16.7%），絮状表皮癣菌5株（3.6%），小孢子菌属10株 （7.2%），其他菌30株（21.7%）。除直接镜检和培养外，所有菌株均采用分子生物学方法，扩增核糖体DNA内转录间区（rDNA ITS）基因序列鉴定到菌种［1］。近平滑念珠菌ATCC 22019为质控菌株。

1.2 抗真菌药

国产盐酸特比萘芬由保定天浩医药销售有限公司提供。对照药为进口盐酸特比萘芬，购自上海市医药工业研究院。

本实验采用美国美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）CLSI⁃M27A3［2］和M38A2［3］文件所推荐的微量液基稀释法（Broth Microdilution）配制上述药物的贮存液及倍比稀释液。

1.3 菌悬液制备

试验前所有受试菌均接种在马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上28℃培养7 d使其活化。在孵育7 d的菌落上加入含有0.01 mL吐温20（1滴）的0.85%盐水1 mL，制备菌悬液；菌悬液静置3～5 min后，大颗粒沉于底部，取上层均质液体（含孢囊孢子或分生孢子以及菌丝片段）；用血细胞计数板将菌悬液浓度用RPMI 1640培养液调整至2×106～1× 107CFU／mL。最后将上述已经配置好的菌悬液用RPMI 1640培养液稀释1 000倍，使其浓度介于2× 103～1×104CFU／mL之间。

1.4 真菌药敏试验

本实验采用2008年临床实验室标准化研究所（CLSI）指南上提出CLSI⁃M27A3［2］和M38A2［3］文件所推荐的微量液基稀释法 （Broth Microdilution）检测待筛选化合物对假丝酵母菌和丝状真菌最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最低有效浓度 （minimal effective concentration，MEC）。特比萘芬的最终工作浓度为0.008～0.5g／mL，结果判定在显微镜下进行。所有菌株均进行2次重复试验。每次试验均包含标准菌株的测定以保证试验准确。

1.4 MIC和MEC的判定

判读结果：30℃静置培养4～7 d后观察结果。

最低抑菌浓度 （MIC）的判定标准：在显微镜下观察，与阳性对照孔对比，完全抑制，无生长的最低浓度。最低有效浓度 （MEC）的判定标准：在显微镜下观察，与阳性生长对照孔比较，50%以上生长抑制。计算所有菌株MIC和MEC的几何均数，以及50%和90%的MEC值或MIC值（菌株少于5株不计算几何均数。菌株少于3株不计算MEC50和MEC90）。

1.5 数据统计分析

应用StatsDirect v2.7.8（StatsDirect，Cheshire，英国）分析软件统计。

2 结 果

所有受试皮肤癣菌菌种在30℃、5～7 d培养后均生长良好，每次试验各质控菌株的MIC值均在参考范围内。采用显微镜下判读药敏板，MIC、MEC结果见表1。国产盐酸特比萘芬对毛癣菌属的MIC范围为0.008～0.25 μg／mL，MEC90：0.125 μg／mL，MIC50：0.008 μg／mL，GM：0.034 μg／mL，MEC范围为 0.008～0.125 μg／mL，MEC90：0.125 μg／mL，MEC50：0.008 μg／mL，GM：0.018 μg／mL。对小孢子菌属的MIC范围为0.016～0.25 μg／mL，MIC90：0.25 μg／mL，MIC50：0.125 μg／mL，GM：0.142 μg／mL，MEC范围为 0.008～0.062 5 μg／mL，MEC90：0.062 5 μg／mL，MEC50：0.016 μg／mL，GM：0.031 4 μg／mL。对表皮癣菌属的MIC范围为0.008～0.125 μg／mL，GM：0.037 μg／mL。对其他角层癣菌的MIC范围为0.062 5～0.25 μg／mL，MIC90：0.25 μg／mL，MIC50：0.125 μg／mL，GM：0.127 μg／mL。

国产盐酸特比萘芬的抗真菌效果与进口特比萘芬的抗真菌效果无显著差异（P＞0.05）。

表1 国产盐酸特比萘芬和进口盐酸特比萘芬对浅部真菌的MIC范围及几何均数（GM）值（μg／mL）Tab.1 MIC range and geometric mean（GM）value of Beijia terbinafine and imported terbinafine to superficial fungi（μg／mL）

3 讨 论

皮肤癣菌的感染仅隐于表皮的角化组织、甲板和毛发，大多数不能独立生存来与其他环境中的嗜角质真菌竞争，需依靠宿主与宿主之间的互相传播方可生存［4］。目前一般将皮肤癣菌分为3个属（毛癣菌属、小孢子菌属、表皮癣菌属）及角层癣菌。角层癣菌包括分离自花斑癣、掌黑癣等一些浅部真菌病的真菌。治疗常用特比萘芬和三唑类药物。盐酸特比萘芬属于人工合成的一种丙烯胺类化合物，主要抑制角沙烯环氧化酶，是强有效的真菌杀菌剂，资料显示该药对浅部真菌病的良好临床疗效［5］。目前国内尚无体外药敏试验来支持这一临床结果。

我们从上海4家三级医院及昆明一家三级医院的皮肤科门诊收收集皮肤癣菌菌株进行盐酸特比萘芬体外药敏试验，菌株来源可以从一定程度上代表我国东南地区浅病真菌病的病原菌。研究结果表明，红色毛癣菌依然是浅部真菌感染的主要病原菌，占50.7%。除毛癣菌属、表皮癣菌属、小孢子菌属外，其他癣菌也占有相当比例 （21.7%），这些真菌包括太田节皮菌、万博节皮菌、申克氏孢子丝菌、威尼克外瓶霉和毛孢子菌。本组的药敏结果显示，盐酸特比萘分对皮肤癣菌具有强效杀菌作用，在0.008～0.25 μg／mL范围均可抑菌。同时，本实验采用浊度仪测定调节待测菌悬液孢子浓度，并与细胞板记数法确认。药敏结果读板采用显微镜下观察，从客观上减少了判读误差。

国产盐酸特比萘芬是国产制剂，其价格较进口特比萘芬有一定优势。从试验结果看，皮肤癣菌对两种盐酸特比萘芬的敏感性无显著差异，提示保定天浩医药有限公司提供的特比萘芬对皮肤癣菌的抑菌作用明显，可作为治疗浅部真菌病的有效药物之一。

致谢：本研究得到国家 973项目（2013CB531601，2013CB531606），国家科技重大传染病专项（2013ZX10004612⁃001）的资助，同时还得到云南省联合专项重点项目（2012FB006）和上海市科委专项（14DZ2272900，12JC141000）对本研究的资助。一并表示衷心感谢。感谢保定天浩制药有限公司提供本研究所用特比萘芬。 参考文献

［1］ Altschul XF，Gish W，Miller W，et al.Basic local alignment search tool［J］.J Mol Biol，1990，215（3）：403⁃410.

［2］ Clinical and Laboratory Standards Institute M27⁃A3.Clinical and Laboratory Standards Institute／National Committee for Clinical La⁃boratory Standards：Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of Yeast，Approved Standard［M］.3th ed.Wayne，PA：2009.

［3］ Clinical and Laboratory Standards Institute M38⁃A2.Clinical and Laboratory Standards Institute／National Committee for Clinical La⁃ boratory Standards：Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of Yeast.Approved Standard［M］3th ed.Wayne，PA：2008.

［4］ Sigurgeirsson B，Baran R.The prevalence of onychomycosis in the global population⁃A literature study［J］.J Eur Acad Dermatol Ve⁃nereol，2014，28（11）：1480⁃91.

［5］ 张成锋，陈连军.抗真菌药在皮肤浅部真菌病治疗中的合理应用［J］.上海医药，2005，211（2）：174.

In vitro susceptibility testing of domestic terbinafine hydrochloride against dermatophytes

TAN Xin1，PAN Wei⁃hua2，DENG Shu⁃wen2，GUO Yun1，LEI Wen⁃zhi2，ZHANG Chao2，ZHOU Zhao⁃jing2，FANG Wen⁃jie2，WEN Yi⁃yang3，SHEN Shuai⁃shuai3，ZHU Shuang2，YAO Zhi⁃rong4，ZHENG Jie5，DENG Dan⁃qi1，LIAO Wan⁃qing2
（1.Department of Dermatology，The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650101；2.Shanghai Key La⁃boratory of Molecular Medical Mycology，Shanghai Changzheng Hospital，Shanghai 200003；3.Department of Dermatology，Shanghai Tongji Hospital，Shanghai 200065；4.Department of Dermatology，Shanghai Xinhua Hospital，Shanghai 200093；5.Department of Der⁃matology，Shanghai Ruijin Hospital，Shanghai 200025）

Objectives To investigate the in vitro susceptibility testing of terbinafine against 138 strains of dermatophytes.Meth⁃ods CLSI M38⁃A2 guideline was applied.The media containing the fungi in the concentration of（0.4⁃5）×104CFU／mL were incuba⁃ted at 30 for 7 days.The MIC endpoint was determined as the first concentration of antifungal agent that reached 100%inhibition of growth compared with the growth control.The MEC endpoint was determined as the first concentration of antifungal agent that reached 50%inhibition of growth compared with the growth control.Results The tested 138 strains of Dermatophytes were susceptible to ter⁃binafine，MEC range：0.008⁃0.125 μg／mL，MIC 0.008⁃0.25μg／mL.There was no statistical differences between Beijia terbinafine and imported terbinafine（P＞0.05）.Conclusion Beija Terbinafine is active aganist Dermatophytes.It can be an effective choice in super⁃ficial mycosis treatment.

domestic terbinafine hydrochloride；dermatophytes；in vitro；antifungal susceptibility tests

R 978.5

A

1673⁃3827（2015）10⁃0022⁃03

2014⁃10⁃21

［本文编辑］ 王 飞

国家自然科学基金（31270180），上海医学真菌分子重点实验室基金（14DZ2272900）

谈鑫，男（汉族），硕士，住院医师.E⁃mail：aids141＠126.com；潘炜华，女（汉族），博士，副主任医师.E⁃mail：panweihua＠med⁃mail.com.cn

廖万清，E⁃mail：liaowanqing＠sohu.com；邓丹琪，E⁃mail：danqid128＠sina.com