白头翁汤正丁醇提取物对白念珠菌VVC临床株黏附作用的影响

张梦翔 夏丹 施高翔 陆克乔 邵菁 吴大强 汪天明 汪长中

（1.安徽中医药大学中西医结合临床学院，合肥230038；2.安徽省中医药科学院中西医结合研究所，合肥，230038）

白头翁汤正丁醇提取物对白念珠菌VVC临床株黏附作用的影响

张梦翔1夏丹1施高翔1陆克乔1邵菁1吴大强1汪天明2汪长中1

（1.安徽中医药大学中西医结合临床学院，合肥230038；2.安徽省中医药科学院中西医结合研究所，合肥，230038）

目的 探讨白头翁汤正丁醇提取物 （Butyl alcohol extract of BaiTouWeng decoction，BAEB）对外阴阴道念珠菌病（Vulvovaginal Candidiasis，VVC）白念珠菌临床分离株黏附作用的影响。方法 平板法检测与BAEB共培养2 h、4 h时白念珠菌的CFU；XTT还原法检测与BAEB共培养2 h、4 h的白念珠菌代谢活性；试管法检测白念珠菌絮凝能力；水⁃烃两相法检测白念珠菌细胞表面疏水性（cell surface hydrophobicity，CSH）；荧光显微镜观察菌体活力；扫描电镜观察白念珠菌细胞形态；qRT⁃PCR法检测黏附相关基因ALS1、CSH1、HWP1、ALS5、ALA1、INT1、MNT2与ALS3的表达。结果 512、1 024 μg／mL BAEB可显著抑制黏附2 h、4 h时的白念珠菌的CFU及代谢活性；肉眼和倒置显微镜下观察发现512、1 024 μg／mL BAEB可明显延缓絮凝产生的时间；256、512、1 024 μg／mL的BAEB均能够显著减少白念珠菌的细胞表面疏水性；qRT⁃PCR检测表明1 024 μg／mL的BAEB作用后，ALS1、CSH1、ALA1、ALS3、INT1、HWP1分别下调18.7%、36%、37.8%、29.6%、19.9%、21.6%，ALS5与MNT2未产生明显变化。结论 BAEB可能通过调节黏附相关基因抑制白念珠菌VVC临床株的黏附作用。

白头翁汤正丁醇提取物；外阴阴道念珠菌病；白念珠菌；黏附

［Chin J Mycol，2015，10（1）：25⁃30］

外阴阴道念珠菌病（Vulvovaginal Candidiasis，VVC）是一种是由念珠菌引起的妇科常见外阴阴道感染性疾病，表现为尿痛、性交痛、尿频等，症状严重时患者坐卧不安，严重影响患者的日常生活［1］。引起VVC的主要病原体为白念珠菌，其通过分泌一系列黏附素黏附并定植于宿主上皮细胞，当宿主免疫力下降或局部微环境平衡被破坏时则造成感染。由于黏附是白念珠菌感染的第一步，因此，抑制白念珠菌黏附对控制其感染至关重要。

近年来，中医药在治疗VVC方面取得了长足进展，从丰富的中药资源中发掘出许多具有抗真菌功效的药物。与传统抗真菌药物相比，中药治疗阴道炎具有疗效稳定、毒性低、不易耐药等优点［2⁃5］。其中白头翁汤就是一种近年来被尝试用于临床治疗VVC的中药复方［6］。本课题组前期实验也发现该复方的正丁醇提取物 （BAEB）有抑制白念珠菌形态转化的作用（待发表）。鉴于黏附在白念珠菌感染中的重要性，本实验拟探讨BAEB干预VVC临床株黏附的分子机制，旨在为其临床运用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌VVC临床分离株（CA01）由安徽中医药大学第一附属医院皮肤性病科刘小平主任惠赠。

药物 白头翁汤按国家中医药管理局统一组织编审的普通高等类教育中医类规划教材《方剂学》中的药物（白头翁、黄柏、黄连、秦皮）组成，购于安徽中医药大学第一附属医院中药房，并经鉴定。使用80%乙醇70℃回流3 h后过滤，收集滤渣，共重复回流3次后，滤液分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇按照极性梯度萃取3次，萃取液65℃旋转蒸发至结晶干燥，得到白头翁汤各溶剂提取物。经过活性筛选发现正丁醇提取物体外抗白念珠菌的活性最强，故本实验以该提取物为供试药；阳性对照药氟康唑（Fluconazole，FLZ）标准品购于中国食品药品检定研究院（批号100314⁃201204）。

试剂 pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS，武汉博士德生物科技有限公司），无水乙醇 （上海苏懿化学试剂有限公司），溶壁酶（Sigma公司），FDA（荧光素双乙酸酯，Sigma公司），25%戊二醛、正辛烷（国药集团化学试剂有限公司），Total RNA提取试剂、PCR反应试剂（日本ToyoBo公司），引物（上海生工生物工程有限公司），XTT（加拿大BBI公司），维生素K3（Alexis公司）。

培养基 制备RPMI 1640液体培养基，滤过除菌，4℃保存备用。沙氏培养基 （青岛高科技海博生物技术有限公司），YPD培养基（北京陆桥技术责任有限公司）。

实验仪器 聚苯乙烯96孔微量培养板，24孔微量培养板（美国Corning公司），DPH⁃9162型电热恒温培养箱 （上海一恒科技有限公司），血细胞计数板 （上海求精生化试剂仪器有限公司），CKX41⁃32型倒置显微镜 （日本 Olympus公司），DMI60000B倒置荧光显微镜（德国徕卡光学仪器公司），扫描电镜（荷兰FEI公司，型号Sirion200），ABI Spectra Max M2e多功能酶标仪 （美谷分子仪器（上海）有限公司），ABI7500荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）。

1.2 方法

菌液配制 从4℃保存的YPD培养平板上挑取单菌落白念珠菌，接种至液体沙氏培养液，37℃、振荡培养箱中过夜培养，离心收集菌体，血细胞计数板计数，RPMI 1640培养液稀释至2×106CFU／mL备用。

平板法检测白念珠菌与BAEB共培养2 h、4 h的CFU变化 取2 mL菌液（2×106CFU／mL）分别与2 mL终浓度为0、256、512和1 024 μg／mL的BAEB和终浓度为128 μg／mL的FLZ于6孔板中混合，37℃培养2 h、4 h后，吸取100 μL培养基，置于新的无菌试管中，加入2 mL无菌PBS混合，稀释后均匀涂布于沙氏平板上，恒温箱37℃培养24 h后取出，计数CFU。

XTT还原法评价与BAEB共培养白念珠菌的代谢活性［7］取浓度为128 μg／mL FLZ和浓度为256、512、1 024 μg／mL的BAEB 100 μL与菌液（2 ×106CFU／mL）100 μL依次加入96孔微量培养板中，并设空白对照组，培养2 h、4 h后吸弃培养基，无菌 PBS轻轻洗去未黏附菌，各孔加入 50 μL XTT，避光继续培养2 h后，492 nm处测定A值。

絮凝实验［8］吸取1×107CFU／mL的菌液2 mL加入试管，再分别加入终浓度为256、512、1 024 μg／mL的BAEB 2 mL，37℃缓慢振摇培养4 h后，涡旋振荡数秒，静置2 min后观察并拍照。

细胞表面疏水性实验［8］白念珠菌细胞表面疏水性采用水⁃烃两相法测定。分别取终浓度256、512、1 024 μg／mL的BAEB与菌液2 mL（浓度为2×106CFU／mL）共孵育24 h后离心，再用无菌PBS重悬，配制成OD600＝1的菌液，每组取1.2 mL悬液于一洁净玻璃试管内，加入0.3 mL正辛烷。旋涡混匀3 min，静置待两相分离。两相分离后立即测定水相的OD600nm值。以不加正辛烷的PBS菌液的OD600值作为阴性对照。CSH计算方法为：相对疏水性＝（OD600对照⁃OD600实验）／OD600对照，并拍照。

荧光显微镜观察白念珠菌活性 取1 mL（2× 106CFU／mL）菌液与1 mL终浓度分别为256、512、1 024 μg／mL BAEB于6孔板中混合，每孔分别置入经75%乙醇浸泡24 h的盖玻片 （1 cm×1 cm），37℃，培养4 h后取出，配制FDA荧光染料至工作浓度（10 mg／L），避光染色30 min，用荧光显微镜观察并拍照。

扫描电镜观察白念珠菌形态 将1 mL菌液（2×106CFU／mL）加入24孔板各孔中，分别加入1 mL终浓度分别为256 μg／mL、512 μg／mL、1 024 μg／mL的BAEB，菌药混合后加入经过灭菌处理的医用导管片，37℃培养4 h后，将待检测的导管片标本取出，以PBS轻洗2次，于预冷2.5%（v／v）戊二醛溶液中避光固定2 h，再次用PBS轻洗2次，乙醇梯度脱水（30%，10 min；70%，10 min；95%，10 min；100%，10 min），过夜干燥后镀金，使用扫描电镜观察并拍照。

逆转录定量PCR（qRT⁃PCR）检测白念珠菌黏附基因的表达 总RNA的提取 2 mL菌液（2× 106CFU／mL）与2 mL终浓度分别为256、512、1 024 μg／mL BAEB混合，37℃孵育4 h后，离心收集菌体，用无菌PBS冲洗3次后进行总RNA提取，调节RNA浓度，使菌体模板量一致。具体操作方法参照ToyoBo公司MagExtractor⁃RNA⁃提取试剂说明书进行。

引物的设计与合成 基因序列从NCBI获得，并用Oligo 7.0软件设计所需引物，委托上海生工合成引物，各引物情况见表1。

反转录为cDNA 6 μL RNA预变性（65℃ 5 min，4℃ 1 min），后加入混合B液2 μL，5RT⁃Master MixII 2 μL混合后按如下条件进行反转录：50℃，5 min；98℃，5 min；4℃，1 min。反应完成后将cDNA稀释10倍备用。

实时荧光定量PCR反应 采用SYBR荧光探针法，反应体系 25 μL：2×SYBR Green Realtime PCR 12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μmol／L）1 μL，PCR Reverse Primer 1 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 10 μL。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行扩增反应，反应条件：预变性95℃ 60 s；扩增定量程序（amplification and quantification program）40个循环，循环参数为：变性95℃ 15 s；退火50℃ 15 s；延伸72℃ 45 s；熔解曲线（melting curve）：60～95℃，加热速率为0.1℃／s。内参基因为ACT1。每个样品均设置3重复，实验重复3次。

定量分析 实时荧光定量PCR分析分别测定目的基因 ALS1、CSH1、HWP1、ALS5、ALA1、INT1、MNT2与ALS3及内参ACT1的Ct值，实验结果取其平均值。基因表达水平用倍数变化来表示（2⁃ΔΔCt法）。

1.3 统计学处理

所有数据应用SPSS 17统计软件分析处理，计量资料以（±s）表示，组间差异比较采用单因素方差分析检验（P＜0.05）。

2 结 果

2.1 BAEB对白念珠菌培养2 h、4 h的CFU的影响

通过计数平板CFU，结果发现BAEB作用白念珠菌2 h和4 h后，512和1 024 μg／mL两个浓度组均能抑制白念珠菌的生长 （结果具有统计学意义），256 μg／mL作用不明显（见图1）。

2.2 BAEB对白念珠菌黏附2 h、4 h代谢活性的影响

XTT检测BAEB对白念珠菌代谢活性，结果发现当药物作用2 h后，与空白组（0 μg／mL）相比，512 μg／mL、1 024 μg／mL组的白念珠菌代谢活力显著下降；药物作用4 h后，与空白组（0 μg／mL）相比三个浓度组均有明显的抑制作用，结果具有统计学意义（见图2）。

2.3 BAEB对白念珠菌絮凝能力的影响

由图3上排可以看出，对照组出现较多絮状物，并且沉降到试管底部，256 μg／mL组也出现少量絮状物，而512、1 024 μg／mL组未出现絮状物。

由图3下排即倒置镜下观察发现，对照组细胞大量黏附堆积，成块状，随着BAEB浓度的不断增加，块状堆积越来越少。

2.4 BAEB对白念珠菌白念珠菌细胞表面疏水性的影响

BAEB作用后，与对照组相比，1 024 μg／mL组烃相（上层）内几乎无浑浊，512 μg／mL、256 μg／mL组烃相（上层）轻度浑浊。由OD值计算显示与空白对照组相比，均有明显差异，结果具有统计学意义（见图4）。

2.5 荧光显微镜观察白念珠菌活性

空白对照组可见大量绿色荧光细胞，随着BAEB的浓度增加，绿色荧光菌体逐渐减少（见图5）。

2.6 扫描电镜观察白念珠菌形态

如图6所示，培养4 h后，空白组可见大量白念珠菌互相黏附堆积，随着BAEB浓度不断增加，黏附在导管表面的菌体越来越少。

2.7 BAEB对白念珠菌黏附基因的影响

与空白组相比，1 024 μg／mL BAEB干预组INT1、ALS3、ALA1、ALS1、CSH1、HWP1分别下调为空白对照组的19.9%、29.6%、37.8%、18.7%、36%、21.6%；512 μg／mL BAEB干预后，上述6个基因中，除INT1外分别下调为空白对照组的34.1%、47.8%、33.6%、40.5%、29.2%；256 μg／mL组上述各基因表达量变化均无明显差异；此外各浓度组中MNT2与ALS5基因均未见明显变化（见图7）。

图1 BAEB对黏附2 h、4 h的白念珠菌CFU的影响（∗.与对照组相比，P＜0.05） 图2 BAEB对黏附2 h、4 h的白念珠菌代谢活力的影响（∗.与对照组相比，P＜0.05） 图3 BAEB对白念珠菌絮凝能力的影响（上排为直接观察，下排为倒置显微镜下观察） 图4 BAEB对白念珠菌细胞表面疏水性影响 图5 荧光显微镜观察BAEB对白念珠菌黏附的影响（×400）：a.对照组，b.256 μg／mL BAEB组，c.512 μg／mL BAEB组，d.1 024 μg／mL BAEB组（∗.与对照组相比，P＜0.05） 图6 电镜下观察BAEB对白念珠菌黏附的影响（×3 000）：a.对照组，b.256 μg／mL BAEB组，c.512 μg／mL BAEB组，d.1 024 μg／mL BAEB组 图7 BAEB对白念珠菌黏附相关基因表达的影响（∗.与对照组相比，P＜0.05）Fig.1 The effect of BAEB on adherent Candida albicans CFU for 2 h，4 h Fig.2 The effect of BAEB on metabolic activity of adherent Candida albicans for 2 h，4 h Fig.3 The effect of BAEB on Flocculation of Candida albicans Fig.4 The effect of BAEB on CSH of Candida albicans Fig.5 Fluorescence microscope images of adherent Candida albicans treated with BAEB（×400）：a.control，b.256 μg／mL BAEB，c.512 μg／mL BAEB，d.1 024 μg／mL BAEB Fig.6 Morphological observation on effects of EAHD Candida albicans adhesion with SEM in 4 h：a.control，b.256 μg／mL BAEB，c.512 μg／mL BAEB，d.1 024 μg／mL BAEB Fig.7 Expression of adhesion genes of Candida albicans treatedwith BAEB by qRT⁃PCR

3 讨 论

在VVC的致病过程中，白念珠菌的黏附是第一步，也是关键的一步［8］。因此，明确药物对其黏附影响的相关机制，对预防及治疗VVC具有重要意义。白念珠菌黏附在生物或非生物介质表面主要是物理化学黏附方式，白念珠菌通过分泌如I型整合素 （Type I intergrin）、I型凝集素样黏附素（Type I Agglutin⁃like adhesion）及I型菌丝孔蛋白（Type I hyphal wall protein）等一系列与黏附有关的蛋白，增强其黏附能力。这些蛋白可能成为药物通过抑制其黏附而发挥抗真菌作用的靶点［9⁃14］。

本实验首先利用平板法检测2 h和4 h时BAEB对白念珠菌抑制能力。结果显示，作用4 h后512与1 024 μg／mL组能够明显抑制白念珠菌的生长，说明BAEB对白念珠菌具有一定的抑制作用。通过XTT还原法检测，培养2 h后，512 μg／mL和1 024 μg／mL的BAEB能显著抑制念珠菌的代谢活性，培养4 h后，所有浓度均能显著抑制白念株菌的代谢活性。

细胞表面疏水性 （Cell surface hydrophobicity，CSH）是白念珠菌的一个重要的毒力因子，由白念珠菌表面的甘露聚糖化蛋白介导。CSH赋予白念珠菌与宿主细胞或非生命基质之间的黏附能力，以及抵御宿主免疫细胞的攻击［15］。絮凝 （floccula⁃tion）系细胞⁃细胞之间的黏附，白念珠菌通过絮凝介导酵母相细胞之间相互黏附进而发育形成生物膜（biofilm）［16］。疏水性实验与絮凝实验结果表明，BAEB能够降低白念珠菌细胞表面疏水性及絮凝能力，减少其细胞之间黏附；扫描电镜也显示随着BAEB浓度增大黏附细胞数不断减少，同时荧光显微镜观察也发现，相比于对照组的大量绿色荧光细胞，BAEB组细胞较稀疏且荧光强度低。

白念珠菌黏附是由一系列黏附相关基因表达的产物⁃黏附附素介导引起的。INT1、ALS3、MNT2、ALA1、ALS1、ALS5、HWP1和CSH1等是目前已知明确的黏附相关基因［9⁃14］，该类基因的表达下调往往会导致白念珠菌对宿主细胞黏附性的下降及致病力的减弱。在1 024、512 μg／mL的BAEB干预下，除MNT2和ALS5表达无明显差异外，上述其他基因与空白对照组相比下调均超过50%，总体效应趋于降低白念珠菌的黏附能力，提示BAEB抑制白念珠菌的黏附可能是通过影响黏附相关基因来发挥作用的。

黏附是白念珠菌致病性的一个重要因素。BAEB作为经典中药复方白头翁汤提取物可有效抑制白念珠菌的黏附，从而有效降低白念珠菌的致病性，这也为白头翁汤临床治疗VVC提供实验依据。但其抗菌的确切的有效组分以及详细的作用机制尚有待于进一步研究。

［1］ 乐杰，谢幸，林仲秋，等.妇产科学［M］.第7版.人民卫生出版社，2008：239⁃240.

［2］ 张瑾，高月平.中药治疗阴道炎研究进展［J］.实用中医药杂志，2009，25（2）：135⁃136.

［3］ 于晓虹，杨国玲，刘晓明，等.氟康唑、特比萘芬和伊曲康唑对白色念珠菌的体外敏感性试验［J］.中国皮肤性病学杂志，2008，22（11）：668⁃669.

［4］ 张文平，王小丽，黄真，等.肉桂醛体外诱导白色念珠菌耐药的实验［J］.中国临床康复，2006，10（35）：148⁃149.

［5］ 王刚生，邓洁华.中药提取组合物（胶囊）对念珠菌及曲霉的体外抗菌实验［J］.时珍国医国药，2010，21（4）：884⁃886.

［6］ 张晓芬，张超云.白头翁汤加味综合治疗复发性念珠菌性阴道病［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（9）：279⁃281.

［7］ 赵柳娅，蒋京辰，姜远英，等.黄芩素与氟康唑协同抗白念珠菌生物被膜作用研究［J］.中国真菌学杂志，2014，9（2）：70⁃74.

［8］ Gelis S，de Groot PW，Castillo L，et al.Pga13 in Candida albi⁃cans is localized in the cell wall and influences cell surface prop⁃erties，morphogenesis and virulence［J］.Fungal Genet Biol，2012，49（4）：322⁃331.

［9］ Sundstrom P.Adhesion in Candida spp［J］.Cell Microbiol Cell Microbiol，2002，4（8）：461⁃469.

［10］ Gaur NK，Klotz SA.Expression，cloning，and characterization of a Candida albicans gene，ALA1，that confers adherence properties upon Saccharomyces cerevisiae for extracellular matrix proteins［J］.Infect Immun，1997，65（12）：5289⁃5294.

［11］ Asleson CM，Bensen ES，Gale CA，et al.Candida albicans INT1⁃induced filamentation in Saccharomyces cerevisiae depends on Sla2p［J］.Mol Cell Biol，2001，21（4）：1272⁃1284.

［12］ GaurNK，Smith RL，Klotz SA.Candida albicansand Saccharomyces cerevisiae expressing ALA1／ALS5 adhere to ac⁃cessible threonine，serine，or alanine patches［J］.Cell Commun Adhes，2002，9（1）：45⁃57.

［13］ Spreghini E，Gismondi A，Piccoli M，et al.Evidence for alphav⁃beta3 and alphavbeta5 integrin⁃like vitronectin（VN）receptors in Candida albicans and their involvement in yeast cell adhesion to VN［J］.J Infect Dis，1999，180（1）：156⁃166.

［14］ Fu Y，Ibrahim AS，Sheppard DC，et al.Candida albicans Als1p：an adhesin that is a downstream effector of the EFG1 filamenta⁃tion pathway［J］.Mol Microbiol，2002，44（1）：61⁃72.

［15］ De Souza RD，Mores AU，Cavalca L，et al.Cell surface hydropho⁃bicity of Candida albicans isolated from elder patients undergo⁃ing denture⁃related candidosis［J］.Gerodontology，2009，26（2）：157⁃161.

［16］ Kevin J，Verstrepen，Frans M Kils.Flocculation，adhesion and biofilm formation in yeasts［J］.Mol Microbiology，2006，60（1）：5⁃15.

Anti⁃adhesion effect of Butyl alcohol extract of BaiTouWeng decoction on Candida albicans isolated from VVC

ZHANG Meng⁃xiang1，XIA Dan1，SHI Gao⁃xiang1，LU Ke⁃qiao1，SHAO Jing1，WANG Tian⁃ming2，WANG Chang⁃zhong1
（1.School of Integrated Traditional and Western Medicine，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230038，China；2.Institute of Integrated Traditional and Western Medicine，Anhui Academy of Chinese Medicine，Hefei 230038，China）

Objective To investigate anti⁃adhesion effect of Butyl alcohol extract of BaiTouWeng decoction（BAEB）on Candida albicans.Methods Agar plate assay was used to determine CFU of Candida albicans for 2h and 4h.XTT reduction assay was applied to evaluate the adherent Candida albicans merabolic activity.Test tube assay was utilized to evaluate flocculation.The water⁃hydrocar⁃bon two⁃phase assay was employed to measure the cell surface hydrophobicity of Candida albicans.Scanning electron microscope（SEM）and fluorescein diacetate（FDA）staining was used to observe the morphological changes of adherent Candida albicans.qRT⁃PCR was adopted to inspect the expression of adhesion⁃related genes such as INT1，ALS3，MNT2，ALA1，ALS1，ALS5，HWP1 and CSH1.Results 512，1 024 μg／mL BAEB could effectively inhibit adherence of Candida albicans.Flocculation was delayed by 512，1 024 μg／mL BAEB.The cell surface hydrophobicity in the BAEB treated groups was lower than that of the control group.The expres⁃sion of ALS1，CSH1，ALA1，ALS3，INT1，HWP1 were downregulated dramatically after BAEB treatment，but ALS5 and MNT2 were un⁃changed.Conclusion BAEB could effectively inhibit adherence of Candida albicans isolated from VVC by regulating adhesion⁃asso⁃ciated genes.

butyl alcohol extract of BaiTouWeng decoction（BAEB）；vulvovaginal candidiasis（VVC）；Candida albicans；adhe⁃sion

R 379.4

A

1673⁃3827（2015）10⁃0025⁃06

2014⁃11⁃21

［本文编辑］ 施 慧

安徽省自然科学基金（1408085MH165），安徽中医药大学校级科研项目（2014zr026）

张梦翔，男（汉族），硕士研究生在读.E⁃mail：tojosaki＠126.com

汪长中，E⁃mail：ahwcz63＠sina.com