CARD9缺陷的暗色丝孢霉病患者中性粒细胞抗白念珠菌免疫功能的研究

梁嫔 王晓雯 万喆 李若瑜

（北京大学第一医院皮肤科 北京大学医学真菌研究中心 皮肤病分子诊断北京市重点实验室，北京100034）

·论著·

CARD9缺陷的暗色丝孢霉病患者中性粒细胞抗白念珠菌免疫功能的研究

梁嫔 王晓雯 万喆 李若瑜

（北京大学第一医院皮肤科 北京大学医学真菌研究中心 皮肤病分子诊断北京市重点实验室，北京100034）

目的 探讨CARD9缺陷的暗色丝孢霉病患者中性粒细胞抗白念珠菌的免疫功能。方法 提取CARD9缺陷患者及正常人外周血中性粒细胞，并使其与白念珠菌进行孵育。采用菌落计数法及MTT法检测中性粒细胞对白念珠菌的杀伤，流式细胞术检测中性粒细胞活性氧的产生及吞噬能力，电镜观察吞噬溶酶体的超微结构，流式微球检测试剂盒检测培养上清中IL⁃8的分泌情况。结果 与对照组比较，CARD9缺陷患者中性粒细胞对白念珠菌孢子的杀伤及IL⁃8的表达存在缺陷，菌丝杀伤能力、活性氧的产生、吞噬能力以及吞噬溶酶体的结构无明显异常，且血清调理后杀伤能力以及IL⁃8的表达得到恢复。结论 CARD9蛋白在中性粒细胞杀伤白念珠菌孢子免疫过程中发挥着关键作用，血清调理可恢复该缺陷。

Candida albicans；CARD9；中性粒细胞；ROS；吞噬；吞噬溶酶体；白细胞介素⁃8

［Chin J Mycol，2015，10（1）：1⁃5］

白念珠菌（Candida albicans）是一种条件致病真菌，当人体免疫功能下降或受损时，可导致皮肤黏膜的感染，严重者可引起侵袭性感染，从而危及生命［1⁃2］。白念珠菌感染的治疗和预防仍未得到有效解决。以往研究证实中性粒细胞在抗真菌免疫反应中发挥着重要作用［3］。中性粒细胞是外周血白细胞中数量最多的细胞类型，是抗真菌免疫中重要的效应细胞，持续的中性粒细胞减少症是侵袭性白念珠菌病的主要危险因素［4］。中性粒细胞可通过吞噬、产生活性氧 （ROS）以及吞噬溶酶体等机制对微生物进行杀伤［5］。

胱天蛋白酶募集域蛋白9（caspase recruitment domain⁃containing protein，CARD9）是细胞C型凝集素受体（CLRs）下游的一种比较重要的接头蛋白（adaptor），其主要表达于髓细胞，尤其是巨噬细胞、树突状细胞以及中性粒细胞［6］。CARD9可与B细胞淋巴瘤因子⁃10（BCL10）、胃肠黏膜相关淋巴组织⁃1（MALT1）结合形成CBM复合物，介导胞内信号的传导，进而参与病原微生物的杀伤［7］。研究发现，CARD9缺陷可致机体抗真菌免疫功能发生缺陷。临床研究已发现CARD9缺陷可致念珠菌脑膜炎、侵袭性皮肤癣菌感染以及外瓶霉感染［8⁃10］；本课题组前期研究亦发现4例疣状瓶霉所致难治性皮肤暗色丝孢霉病患者存在CARD9缺陷［11］，但这些患者对白念珠菌并不易感。那么，这些CARD9缺陷的暗色丝孢霉病患者抗白念珠菌免疫反应是否正常？Drewniak等［8］报道CARD9缺陷可导致中性粒细胞杀伤白念珠菌功能的异常。那么，我们所研究的暗色丝孢霉病患者，其CARD9的缺陷是否影响中性粒细胞对白念珠菌的杀伤功能？

本研究通过建立CARD9缺陷患者中性粒细胞与白念珠菌共培养体系，测定了中性粒细胞对白念珠菌孢子和假菌丝的杀伤，并检测中性粒细胞受到白念珠菌刺激后其活性氧ROS的产生、吞噬能力、吞噬溶酶体结构以及 IL⁃8的表达，初步探索CARD9缺陷的疣状瓶霉感染所致皮肤暗色丝孢霉病患者中性粒细胞抗白念珠菌的免疫功能。

1 材料和方法

1.1 材料

细胞 抽取存在CARD9缺陷的暗色丝孢霉病患者及健康志愿者外周血，通过密度梯度离心的方法提取中性粒细胞，转至24孔板。

菌株 C.albicans（SC 5314）接种于马铃薯斜面培养基（PDA），35℃培养48 h，制成含孢子浓度为1×108／mL的菌悬液备用。

主要试剂 马铃薯葡萄糖琼脂PDA（BD Bio⁃sciences，美国）；胎牛血清（Hyclone，澳洲）；中性粒细胞分离液 （Axis⁃Shield，挪威）；二氢罗丹明DHR123（Sigma⁃Aldrich，美国）；脂多糖LPS（Sig⁃ma⁃Aldrich，美国）；MTT染料 （Sigma⁃Aldrich，美国）；荧光抗体：人IL⁃8流式微球检测试剂盒 （BD Biosciences，美国）。

1.2 方法

菌株制备 假菌丝的制备：取1 μL孢子悬液（1×108／mL）于24孔板1 mL体系中，于37℃孵育过夜，待其长出一薄层菌落；孢子灭活：孢子悬液煮沸30 min；孢子调理：将孢子悬液与10%人外周血清于37℃孵育15 min，PBS洗涤3次，并重悬［8］。

白念珠菌孢子杀伤 将白念珠菌孢子与中性粒细胞于37℃孵育。其中，细胞 ∶孢子＝5∶2，于30 min、120 min时间点用 pH＝11.0的0.001M NaOH裂解细胞，5 min后，将孵育产物涂于PDA板上，于37℃孵育17 h进行菌落计数，并计算中性粒细胞的杀伤比例［8］。

白念珠菌假菌丝杀伤 中性粒细胞与白念珠菌菌丝于37℃孵育4 h（细胞 ∶菌丝＝10∶1），用pH＝11.0的0.001M NaOH裂解细胞，5 min后，PBS洗涤，用MTT染料与菌丝进行孵育3 h，分光光度计检测OD值［8］，通过以下公式计算菌丝的活力（%）：菌丝活力（%）＝［（菌丝与中性粒细胞共孵育孔A570⁃中性粒细胞孔A570）／菌丝孔A570］× 100。

中性粒细胞活性氧检测 根据以往文献报道［12］，将中性粒细胞与DHR123（10 μM）于37℃孵育15 min，向中性粒细胞中加经过血清调理及未调理的白念珠菌孢子进行孵育（细胞 ∶孢子＝1∶10），于相应时间点用流式细胞仪检测ROS的产生。

中性粒细胞吞噬检测 根据以往文献报道［8］，将白念珠菌孢子与DHR123（10 μM）于37℃孵育10 min，离心，PBS洗涤，使其再与人外周血清共孵育进行调理。将DHR标记的调理及未调理的白念珠菌孢子加入中性粒细胞悬液中（细胞∶孢子＝1∶10）。于相应时间点，用流式细胞仪检测中性粒细胞的吞噬。

中性粒细胞吞噬溶酶体结构分析 根据以往文献报道［8］，将中性粒细胞与白念珠菌孢子于37℃孵育过夜（细胞∶孢子＝1∶10），0.2%的戊二醛固定，制备超薄电镜切片，于电镜下观察中性粒细胞吞噬溶酶体结构。

中性粒细胞IL⁃8检测 将中性粒细胞与LPS、血清调理及未调理的白念珠菌孢子于37℃孵育过夜（细胞 ∶孢子＝1∶10），取细胞上清，用流式微球检测试剂盒检测细胞上清IL⁃8的表达水平。

1.3 统计分析

用SPSS 16.0统计软件分析全部数据，数据使用mean±s表示。采用单因素方差分析 （ANO⁃VA），两组间的均数比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CARD9缺陷中性粒细胞对白念珠菌的杀伤效应

120 min时间点CARD9缺陷中性粒细胞对白念珠菌孢子的杀伤能力较正常组明显降低（P＝0.008），但在血清存在（调理）的情况下，杀伤能力可恢复正常（P＞0.05，见图1a）；CARD9缺陷中性粒细胞对白念珠菌菌丝的杀伤能力无明显异常（P＝0.257，见图1b）。

2.2 CARD9缺陷中性粒细胞活性氧ROS产生

与对照组中性粒细胞比较，CARD9缺陷细胞产生ROS的水平无明显差异（P＞0.05，见图2a）。

2.3 CARD9缺陷中性粒细胞对白念珠菌孢子的吞噬以及吞噬溶酶体超微结构分析

CARD9缺陷中性粒细胞对调理及未调理白念珠菌孢子的吞噬较正常组无明显异常 （P＞0.05），且吞噬溶酶体的超微结构亦无明显异常（见图2b，2c）。

2.4 CARD9缺陷中性粒细胞IL⁃8的表达

在LPS的刺激下，CARD9缺陷中性粒细胞IL⁃8的表达与正常人中性粒细胞相比，无明显异常（P＞0.05）；然而在白念珠菌孢子的刺激下，CARD9缺陷中性粒细胞IL⁃8的表达明显低于健康志愿者中性粒细胞（P＝0.005），且在血清存在的情况下，IL⁃8的表达即可恢复正常（P＝0.117，见图2d）。

3 讨 论

机体一旦发生感染，固有免疫系统即可启动早期且有效的抗微生物防御功能，攻击病原体并进行杀伤［13］。研究发现，CARD9缺陷可致机体对病原微生物的易感性增加。Drewniak等报告CARD9缺陷可致念珠菌脑膜炎，且患者中性粒细胞对白念珠菌的杀伤存在严重缺陷［8］。本研究发现，患者中性粒细胞对白念珠菌孢子的杀伤存在缺陷，与正常人对照组相比差异有统计学意义。但在血清存在的情况下，该缺陷可得到恢复。由此推测，血清中存在的调理素（如补体或免疫球蛋白），通过与吞噬细胞表面的补体受体（如CR3）或免疫球蛋白受体（如FcγR）结合，促进了吞噬细胞对病原体的吞噬杀伤［14⁃16］。Gazendam等［17］证实在抵抗白念珠菌反应中，血清调理主要依赖抗白念珠菌表面成分的IgG抗体，通过其与中性粒细胞表面的FcγRs结合，增强CARD9缺陷中性粒细胞杀伤的功能。另外，本研究还发现，患者中性粒细胞对白念珠菌假菌丝的杀伤无明显异常。这可能与白念珠菌假菌丝表面成分的改变有关。白念珠菌菌丝表面主要成分为甘露糖，其可被甘露糖特异性受体如TLR⁃2、TLR⁃4、Dectin⁃2等识别，启动CARD9非依赖信号通路对菌丝进行杀伤［18⁃19］。

我们在实验中发现，患者中性粒细胞受到调理及未调理白念珠菌孢子刺激后，其ROS的产生、吞噬能力及吞噬溶酶体的超微结构均无明显异常。Gazendam等［17］证实在抗白念珠菌反应中，CARD9不参与中性粒细胞ROS的产生，且CARD9介导的杀伤机制与调理素介导的杀伤途径不同，后者通过FcγRs⁃Syk⁃PKC信号通路激活NADPH氧化酶活性，诱导呼吸爆发，从而对白念珠菌进行杀伤。本研究中尽管CARD9缺陷中性粒细胞对白念珠菌的杀伤存在缺陷，但该缺陷于血清调理后即可恢复正常，且在没有血清存在的情况下，CARD9缺陷并未导致中性粒细胞ROS产生的异常，这也再次证实了在没有血清存在的情况下，患者中性粒细胞对白念珠菌孢子的杀伤依赖CARD9介导的信号通路，且该通路是ROS非依赖性的。

另外，本实验发现，LPS刺激中性粒细胞后，其IL⁃8的产生并未受到CARD9缺陷的影响。LPS是Toll样受体 （TLR）激动剂，CARD9介导的是TLR非依赖性信号通路［7］，因此CARD9的缺陷并未影响LPS诱导的 IL⁃8的产生。然而，在本试验中CARD9缺陷中性粒细胞于白念珠菌孢子刺激后，其IL⁃8的表达存在严重缺陷。白念珠菌孢子表面主要含β⁃葡聚糖等成分，C型凝集素受体（CLRs）是其主要识别受体，而CARD9主要介导CLRs如dectin⁃1／2、Mincle等的信号传导［20］，因此CARD9缺陷可严重影响白念珠菌刺激后中性粒细胞IL⁃8的产生。IL⁃8是中性粒细胞产生的最重要的细胞因子之一，其可趋化免疫细胞至感染部位发挥抗感染作用［21］。IL⁃8缺陷可致感染部位炎症细胞趋化减少，机体抗感染能力减弱。然而，在血清存在的情况下，患者中性粒细胞IL⁃8的表达可通过调理素（补体或免疫球蛋白）介导的调理途径恢复正常。这在一定程度上补偿了CARD9信号通路介导的IL⁃8表达的缺失，从而对效应细胞的募集起到了促进作用。

图1 中性粒细胞对白念珠菌孢子及菌丝的杀伤。a.CARD9缺陷及正常中性粒细胞对白念珠菌孢子的杀伤效应。CARD9缺陷和正常中性粒细胞与白念珠菌孢子共孵育2 h，计算菌落计数单位检测中性粒细胞的杀伤效应；b.CARD9缺陷及正常中性粒细胞对白念珠菌菌丝的杀伤效应。CARD9缺陷和正常中性粒细胞与白念珠菌菌丝共孵育4 h。P＜0.05有统计学意义。∗∗，P＜0.01 图2 检测中性粒细胞ROS、吞噬、溶酶体超微结构以及IL⁃8的分泌。a.中性粒细胞ROS产生的检测。二氢罗丹明DHR123∶10 μM，CARD9缺陷以及正常中性粒细胞与白念珠菌孢子（MOI 10）共孵育，流式检测DHR反应。b.CARD9缺陷以及正常中性粒细胞对DHR标记的白念珠菌孢子的吞噬。c.CARD9缺陷和正常中性粒细胞与白念珠菌孢子孵育过夜，电镜检测吞噬溶酶体超微结构。d.患者及正常人中性粒细胞与以上刺激物共孵育过夜，收集培养上清，用流式微球检测法（CBA）检测IL⁃8的浓度。∗，P＜0.05；∗∗，P＜0.01Fig.1 Killing of C.albicans conidia and hyphae by neutrophils.a.Killing of C.albicans conidia by CARD9⁃deficient and control neutrophils.The neutro⁃phils were incubated with C.albicans conidia for 2 hours.Killing efficacy of CARD9⁃deficient and control PMNs against unopsonized and opsonized C.al⁃bicans conidia was assessed using a standard colony forming unit assay.b.Killing of C.albicans hyphae by CARD9⁃deficient and control neutrophils.The neutrophils were incubated with a monolayer of C.albicans hyphae for 4 hours.∗∗，P＜0.01 Fig.2 Assays of ROS production，phagocytosis，phagoly⁃sosome formation and IL⁃8 secretion by human neutrophils.a.To assess the effect of CARD9 deficiency on the production of ROS，CARD9⁃deficient and control PMNs were co⁃cultured with C.albicans conidia（MOI 10）in the presence of DHR（10 μM）.The DHR response was determined using flow cy⁃tometry.b.The phagocytosis assay of DHR⁃labeled unopsonized and opsonized C.albicans conidia by CARD9⁃deficient and control neutrophils.c.The ul⁃trastructural analysis of the phagolysosome after CARD9⁃deficient and control neutrophils co⁃cultured overnight with unopsonized C.albicans.d.IL⁃8 se⁃cretion by human neutrophils after incubation with C.albicans.PMNs from the patients and control subjects were incubated overnight with the indicated stimuli.The culture supernatants were then collected，and the concentration of IL⁃8 was assessed using cytometric bead array（CBA）.∗，P＜0.05；∗∗，P＜0.01

综上所述，我们的研究初步表明，在CARD9缺陷的暗色丝孢霉病患者中，CARD9可能参与了中性粒细胞对白念珠菌的杀伤以及IL⁃8的表达，但在血清存在的情况下，CARD9缺陷所致中性粒细胞功能的缺陷可得到恢复。由于血清中的血浆蛋白（包括补体蛋白或免疫球蛋白）可经过毛细血管动脉段渗透到皮下组织间液中，且蛋白成分不发生改变［22］，我们推测，组织间液中的蛋白成分 （如补体蛋白或免疫球蛋白）通过促吞噬杀伤途径在中性粒细胞杀伤白念珠菌中发挥了重要作用。这也为CARD9缺陷所致不同微生物感染的具体机制的研究提供了基础。

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Functional studies of neutrophils from phaeohyphomycosis patients with CARD9 deficiencies against Candida albicans

LIANG Pin，WANG Xiao⁃wen，WAN Zhe，LI Ruo⁃yu
（Department of Dermatology，Peking University First Hospital，the Research Center for Medical Mycology，Peking University，Beijing Key Laboratory of Molecular Diagnosis on Dermatoses，Beijing 100034，China）

Caspase recruitment domain⁃containing protein 9（CARD9）is an adaptor molecule that is critical for NF⁃κB activa⁃tion，and forms a complex with B⁃cell lymphoma 10（BCL10）and mucosa⁃associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1（MALT1）that mediates C⁃type lectin receptors（CLRs）⁃triggered intracellular signaling during antifungal immunity.In the present study，we investigated the functions of polymorphonuclear neutrophils（PMNs）from phaeohyphomycosis patients with CARD9 defi⁃ciencies against Candida albicans（C.albicans）.PMNs were isolated from patients and healthy blood donors and subsequently chal⁃lenged withC.albicans.By calculating colony⁃forming units and MTT assay，the killing of C.albicans by CARD9⁃deficient neutrophils was detected，and the ROS production and phagocytotic ability of CARD9⁃deficient neutrophils was assayed by Flow CytoMetry（FCM）.The phagolysosome ultrastructure and the secretion of IL⁃8 were analyzed separately by EM and CBA kit.As a result，we demonstrated that，compared with healthy donors，CARD9⁃deficient PMNs exhibited defects in C.albicans killing and IL⁃8 produc⁃tions，which can be rescued in the presence of serum；however，the CARD9⁃deficient PMNs exhibited normal reactive oxygen species generation，phagocytotic ability and phagolysosome ultrastructure.In conclusion，our results indicate that CARD9 is indispensable for C.albicans killing by PMNs，and serum⁃opsonization acts as a CARD9⁃independent way，which could be a promising immunotherapy in the future.

Candida albicans；CARD9；Neutrophils；ROS；Phagocytosis；Phagolysosome；IL⁃8

R 379.4

A

1673⁃3827（2015）10⁃0001⁃05

2014⁃11⁃04

［本文编辑］ 卫凤莲

国家自然科学基金（81472890，81171510）

梁嫔，女（汉族），博士研究生在读.E⁃mail：liangpinok2014＠163.com

李若瑜，E⁃mail：mycolab＠126.com