基于焦磷酸测序技术的基因突变检测在精准医疗中的应用研究进展

李靖轩，金益如，徐吟秋，宋沁馨*，周国华

（1. 中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏 南京210009；2. 中国药科大学药物分析教研室，江苏 南京210009；3. 南京军区南京总医院药理科，江苏 南京210002）

基于焦磷酸测序技术的基因突变检测在精准医疗中的应用研究进展

李靖轩1，2，金益如1，2，徐吟秋1，2，宋沁馨1，2*，周国华3

（1. 中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏 南京210009；2. 中国药科大学药物分析教研室，江苏 南京210009；3. 南京军区南京总医院药理科，江苏 南京210002）

基因突变检测在肿瘤等疾病的早期诊断、个体化给药指导、疾病治疗进程与耐药监控等方面具有极其重要的意义。随着测序技术的不断发展，DNA突变的检测与分析已为病毒感染、血液病和实体瘤等疾病的个体化诊治提供重要参考。焦磷酸测序技术是一种基于生物发光法测定焦磷酸盐的实时DNA测序技术，其用于DNA序列分析时不需电泳和荧光标记，定量性能好，结果准确，易于实现自动化，在基因突变检测分析与肿瘤等疾病诊治中发挥巨大作用。综述基于焦磷酸测序技术的基因突变检测在分子靶向个体化治疗和疾病诊断中的应用研究进展。

焦磷酸测序；基因突变；个体化治疗；疾病诊断

基因突变在肿瘤等其他疾病的发生、发展以及治疗过程中产生耐药等进程中发挥重要作用，而肿瘤的特征之一就是人基因组的不稳定性和突变［1］。因此，基因突变的检测在肿瘤早期诊断、指导个体化给药、监控治疗进程中耐药发生等方面具有极其重要的意义［2］。随着测序技术的不断发展，在个体化肿瘤诊治领域，DNA突变的检测与分析已经为很多实体肿瘤和恶性血液病的个体化治疗提供了重要参考。例如：在应用酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗非小细胞肺癌（NSCLC）以及抗表皮生长因子受体（EGFR）单抗治疗结直肠癌（CRC）前，首先对 EGFR 和KRAS 基因的突变情况进行检测分析［3］；此外，乳头状甲状腺癌和转移性恶性黑色素瘤 BRAF 基因V600E突变靶向药物维罗非尼（vemurafenib）在用于肿瘤的诊治过程中，均需通过

基因测序来检测患者BRAF 基因V600E突变状况，从而判断药物适用与否。

焦磷酸测序（pyrosequencing）技术（Ronaghi等，Science， 1998年）是基于单个碱基逐个延伸反应的原理，可以克服Sanger测序法（双脱氧核苷酸链终止法）的缺点，是Sanger测序法的重要补充。其原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶（luciferase）和三磷酸腺苷双磷酸酶等4种酶的协同作用下，引物上每一个脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。采用该技术进行DNA序列分析时，不需电泳或荧光标记，可以直接测定引物后面的碱基序列，定量性能好，结果准确，适合对大样本进行快速检测，易于实现自动化。因此，焦磷酸测序技术在基因突变检测分析与肿瘤诊断和治疗中可发挥巨大作用。

1 基于焦磷酸测序技术的基因突变检测在分子靶向个体化治疗中的应用研究

1.1 指导肺癌靶向治疗的基因突变检测

肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，而NSCLC约占肺癌病例的80%～85%，其1/3患者在初次确诊时已经处于局部晚期，错过手术的最佳时机，中位数生存期仅4～5个月［4］。以手术、化疗和放疗为主的传统治疗方法如今已经进入一个瓶颈期，而分子靶向治疗正逐渐成为晚期NSCLC的重要治疗手段。以表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）为代表的分子靶向治疗可延长NSCLC患者的生存期，但是EGFR-TKI的疗效与EGFR或KRAS基因突变密切相关：EGFR基因18、19、21号外显子突变是EGFRTKI的敏感指标，而EGFR基因20号外显子T790M突变和KRAS基因突变则是EGFR-TKI的耐药指标［5］。因此，在接受EGFR-TKI治疗前进行EGFR/KRAS基因检测对指导靶向治疗非常重要。

Tsiatis等［6］应用Sanger测序法、焦磷酸测序法和高分辨率熔解曲线（HRM）法对180例甲醛溶液固定样本和石蜡包埋样本（其中，58例未转移CRC，42例转移性结直肠癌，63例未转移和17例转移性肺腺癌）和20个正常结肠样本的KRAS基因12、13号密码子的突变进行检测，结果发现，180例癌症样本中62.2%的KRAS基因发生突变，37. 8%未发生突变。其中，HRM法检测时，有10%的样本并不能给出明确的结论，但并未发生阳性或阴性的检测错误；焦磷酸测序法检测时，也未发生阳性或阴性检测错误；Sanger测序法检测时，有11.1%的阳性和6. 1%的阴性检测错误。此外，该研究发现，Sanger测序法、焦磷酸测序法和HRM法的检测灵敏度分别约为15%～20% 、5%和10%的等位基因突变。

Kim等［7］应用焦磷酸测序技术检测202例肺癌患者的石蜡包埋样本EGFR基因18～21号外显子突变，结果显示，样本EGFR基因突变率为26.7%（54/202），其中女性（与男性相比，52.1% vs 13.0%）、不抽烟者（与抽烟者相比，47.8 % vs 15.8%）、腺癌（与非腺癌相比，35.2% vs 5.2%）样本中活性EGFR基因突变更为常见；EGFR基因突变与对EGFR-TKI药物的反应密切相关，具有EGFR基因活性突变和野生型的患者对药物敏感性分别为82.4%和5.9%；而且在临床治疗过程中，女性、不吸烟和腺癌的患者其疗效均好于男性、吸烟和非腺癌的患者。此研究表明，EGFR基因突变与良好的临床参数指标（女性、不吸烟、腺癌等）在预测疾病治疗效果的时候有良好的一致性和相关性；焦磷酸测序技术不仅可以检测石蜡包埋组织中的基因突变，还能很好地预测临床上患者对EGFR-TKI治疗的响应。可见，焦磷酸测序技术是一个灵敏、快速、简单的基因测序平台。

Ulivi等［8］在探索基因突变检测的最优样本来源时，应用直接测序法和焦磷酸测序法检测疑似NSCLC患者新鲜和固定后的纵膈淋巴结及附近组织中EGFR和KRAS基因突变，并将结果进行对比。32名患者（25名为腺癌，7名为鳞状细胞癌）的EGFR基因突变检测结果：新鲜组织中2例阳性，固定后组织中3例阳性；KRAS基因突变检测结果：新鲜组织中8例阳性，固定后组织中9例阳性。该研究表明，相较于新鲜组织，固定和染色后的样本更易于分子检测，究其原因，可能是新鲜组织中大量非肿瘤细胞的存在影响了检测结果。

NSCLC分子靶点EGFR或KRAS的基因检测大多需要肿瘤组织样本。然而，临床上经常遇到无法获得肿瘤组织样本的情况，使得EGFR或KRAS基因检测难以开展，限制了NSCLC患者的分子靶向治疗选择。因此，探索组织样本的良好替代物及检测方法至关重要。

Akca等［9］应用焦磷酸测序技术检测52例NSCLC患者循环肿瘤细胞DNA样本的EGFR基因突变，其间，经焦磷酸测序技术检测的所有血清DNA突变样本，均用Sanger测序法验证，并用同一患者的石蜡包埋组织进行验证。结果，从血清DNA中检测到21例（40.4%）样本存在EGFR基因突变，其中，14例为E746-A750缺失，2例为E747-A750缺失，5例为L858R突变；石蜡包埋组织检测到25例（48.1%）样本存在EGFR突变，其中，17例为E746-A750缺失，2例为E747-A750缺失，6例为L858R突变；Sanger测序法检测到21例（40.4%）样本存在EGFR突变，其中，14例为E746-A750缺失，2例为E747-A750缺失，5例为L858R突变。此外，还发现，腺癌患者的EGFR基因突变率（24/36， 66.7%）比鳞状细胞癌患者（1/16， 6.3%）更高。该研究表明，焦磷酸测序技术可有效用于检测早期NSCLC患者血清DNA的EGFR突变，且在检测EGFR突变时，焦磷酸测序技术较Sanger测序法更灵敏，其灵敏度足以实现对血清中DNA和石蜡包埋组织中DNA的检测。

孙洁等［10］收集了63例晚期NSCLC患者的外周血标本，分离血浆并提取DNA，采用巢式PCR结合焦磷酸测序技术检测KRAS基因12和13号密码子的突变。结果显示，63例NSCLC患者中，3例（4.76%）KRAS基因突变阳性，其中，2例是12号密码子突变，1例是13号密码子突变；患者血浆KRAS突变率均较低，与文献报道的亚裔组织KRAS突变率一致，低于西方人的KRAS突变率。

1.2 指导结直肠癌靶向治疗的基因突变检测

CRC是常见的消化系统恶性肿瘤，而KRAS基因突变在CRC形成过程中起重要作用。近年来的研究表明，KRAS基因突变状况与CRC预后密切关联，是判断CRC患者预后的重要指标［11］。而且，分子靶向药物EGFR抑制剂西妥昔单抗（cetuximab）治疗晚期CRC的效果与患者KRAS基因是否突变极为有关：KRAS基因野生型患者对西妥昔单抗敏感，而KRAS基因突变型患者对其不敏感。因此，KRAS基因是否突变可以作为西妥昔单抗的用药判断标准［12］。于是，快速、准确、灵敏地检测KRAS基因突变状况，有助于临床上合理、精准制定CRC治疗方案。

王树新等［13］欲探索不同的方法检测CRC组织中KRAS基因点突变的差异，分别采用焦磷酸测序法和双脱氧测序法检测60例CRC患者石蜡包埋组织样本中KRAS基因的第12和14号密码子，并对检测结果进行对比分析。结果显示，两种方法均能够检测到KRAS基因突变，但是灵敏度各有不同：两种方法对5例样本的检测结果不一致；焦磷酸测序法和双脱氧测序法分别检测出20例（33.3%）和15例（25%）KRAS基因突变，前者检出率高于后者。对肿瘤细胞的病理分析发现，5例双脱氧测序法漏检的样本中均有较多的炎症细胞，肿瘤细胞则较少，不足20%，这可能是造成双脱氧测序法漏检的原因。该研究表明，在检测KRAS基因突变的过程中，样本中肿瘤细胞所占比例是影响检测结果的关键因素；焦磷酸测序技术比双脱氧测序法更灵敏，可以同时进行96个测序反应，不必对PCR产物进行特殊的纯化处理，整个测序过程时间短，灵敏度可达5%。

黄新等［14］应用焦磷酸测序法检测116例Ⅳ期原发性和11例转移性CRC病灶中KRAS基因第12和13号密码子上的点突变，结果，116例Ⅳ期原发性CRC样本中，有29例检出KRAS基因点突变阳性，突变率为25%，其中，24例（82.8%）为12号密码子点突变，5例（17.2%）为13号密码子点突变。可见，29例突变样本第12号密码子突变频率高于第13号密码子，且均为错义突变，与以往的报道一致［15］。此外，该研究中，116例Ⅳ期CRC KRAS基因突变频率与文献报道亚洲人CRC基因突变率（17%～28%）大致相同，且未发现进展期CRC的突变情况与早期CRC有明显差异；11例转移病灶中的KRAS基因状态与其原发病灶高度一致，说明KRAS基因突变在CRC早期形成过程中便已发生，因此，在对转移性CRC患者进行KRAS基因检测时，无论选择原发灶还是转移灶进行检测，都是合理的，而患者KRAS基因的状态可以指导对分子靶向药物（如西妥昔单抗）的选择。

王璇等［16］采用焦磷酸测序法检测67例CRC患者石蜡包埋样本的KRAS基因突变状况，结果，检测出26例（38.8%）KRAS基因突变样本，其突变大多发生在第12号密码子。该研究小组在分析突变类型和临床参数之间的关系后发现，女性患者的KRAS基因突变率（57.7%）明显高于男性患者（26.8%）；有淋巴结转移的患者其KRAS基因突变率（58.8%）高于无淋巴结转移者（32.0%）；而KRAS基因突变与患者的年龄、肿瘤所在部位、肿瘤浸润深度、组织学类型和肿瘤分

期均无显著相关性。提示，焦磷酸测序技术可以用于快速检测KRAS基因突变，且KRAS基因突变在女性CRC患者和淋巴转移的患者中更为多见。这些结论均可作为临床上判断CRC患者预后的重要参数。

de Macêdo等［17］研究了KRAS基因突变与CRC病人病理变化和临床具体参数等信息的相关性，其间，通过偶联巢式PCR优化了焦磷酸测序法，用于检测KRAS基因突变，无需重复提取DNA和PCR扩增，成功率接近100%。该研究团队利用巢式PCR偶联焦磷酸测序技术对421例未经选择的CRC患者的KRAS基因进行检测，检测对象均为石蜡包埋的组织。检测结果显示，421名患者中，KRAS基因突变率达33%，其中12号密码子突变占76%，13号密码子突变占24%。且该研究团队在比较KRAS基因突变与临床参数之间的关系时发现，肿瘤组织右侧的突变大于且左侧的突变，这与神经侵袭相关。可见，将巢式PCR和焦磷酸测序技术融合，可获得高确定性检测结果，能用于常规化验的辅助测试。

Kosmidou等［18］应用焦磷酸测序法和Sanger测序法检测171例CRC腺癌患者的KRAS、BRAF、PIK3CA基因突变情况，结果发现，在同一个肿瘤中，BRAF基因突变经常与KRAS基因突变成负相关，说明这两个基因在肿瘤的形成和发展中所起的作用是相互影响的。而且，焦磷酸测序法检测结果显示，171例患者组织样本中，92例（53.8%）的KRAS基因12或13号外显子上有突变，并有2.3%的BARF基因突变及3.5%的PIK3CA基因突变；共检测出的126个突变，其中57.9%是c.38G→A突变，22.2%是c.35G→T突变；50.7%的样本存在肿瘤组织中心和外周的基因突变率不同的现象，且年龄、性别、淋巴结是否转移、肿瘤的位置等差异也会导致突变频率不同。此外，从检测结果中能够看出明显的肿瘤异质性，即同一肿瘤组织的不同位置基因突变率不同，这些都可能影响肿瘤分子诊断检测和个体化治疗的效果。并且，焦磷酸测序法检测出的突变样本中有9个突变样本Sanger测序法无法检出，表明焦磷酸测序技术在检测KRAS基因突变时比Sanger测序技术更灵敏，能检测到3%～5%的突变。

Dobre等［19］利用焦磷酸测序技术检测250例CRC患者KRAS基因12、13、61号外显子的突变情况，并随机选择100例患者用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法进行对比。结果，焦磷酸测序技术检测的250例患者中，KRAS基因突变率为46.4%，大部分突变发生在12号外显子上，小部分在61号外显子上；在对照组的100例样本中，PCR-RFLP法检测到48例突变，而焦磷酸测序技术检测到49例突变，且PCRRFLP法检测到的突变均可以用焦磷酸测序技术进行验证。该研究表明，这两种检测方法的灵敏度足以用于对CRC患者进行分子诊断，以建立适当的治疗方式。而且，该研究小组建议，检测大的肿瘤样本时，使用PCR-RFLP法，因为这样的样本DNA浓度较高，且PCR-RFLP法相对便宜，而检测小的肿瘤样本组织（如穿刺样本）时，应选用焦磷酸测序法，因为这时癌细胞浓度小，此法较为灵敏。

Altimari等［20］比较了Sanger测序法、ARMSScorpion法、焦磷酸测序法和杂交芯片法检测60例CRC样本中KRAS基因12和13号密码子突变的灵敏性、特异性和准确性，结果，检测发现，60例样本中有20例KRAS基因为野生型；Sanger测序法、ARMSScorpion法、焦磷酸测序法和杂交芯片法的特异性均为100%，灵敏度分别为85%、90%、93%和92%，准确度分别为90%、93%、95%和95%；Sanger测序法的局限性在于其分析灵敏度较低，低于其他3种方法。该研究团队还比较了目前经常使用的几种基因突变检测方法，结果表明，在诊断CRC KRAS基因突变时，焦磷酸测序法是一个较为合适的方法。

2 基于焦磷酸测序技术的基因突变检测在疾病诊断中的应用研究

2.1 用于线粒体疾病诊断的基因突变检测

人线粒体DNA是一个环状DNA分子，用于编码一些蛋白质翻译时所需的氧化磷酸酶。线粒体DNA 3243位A→G的突变可以导致母体遗传性糖尿病和耳聋，即线粒体糖尿病，又称母系遗传糖尿病伴耳聋综合征。然而，常用的Sanger测序法其灵敏度不足以检测出这种突变。Yan等［21］应用焦磷酸测序技术定量检测无血缘的83名线粒体糖尿病患者白细胞线粒体DNA中A3243G突变，同时为了验证结果的准确性，用焦磷酸测序法、Sanger测序法和PCR-RFLP法分别对人工标准样品进行检测，并对比。结果表明，焦磷酸测

序法的检测准确性高于其他方法，灵敏度达2%，而A3243G突变有可能成为线粒体糖尿病的发病预测标志。

线粒体转移核糖核酸（mt-tRNA）突变是最常见的与人类疾病相关的线粒体突变的子类型（mtDNA）突变。患有多系统线粒体疾病的患者其特征是肌肉病变、脊髓运动失调、感音神经性听力损失、白内障和认知障碍等，通常存在m.7539C→T突变。Lehmann等［22］应用焦磷酸测序法证实了mtDNA突变的异质性。

2.2 用于甲状腺癌诊断的基因突变检测

细针穿刺细胞学是用于区分良性和恶性甲状腺结节的主要手段，然而约20%～40%的检测结果是不确定的，需要辅助诊断测试来确认其结果。而RAS基因突变已经作为甲状腺癌分型的标志物。Guerra等［23］对37例甲状腺疾病患者（16例良性增生性结节，21例甲状腺滤泡癌）进行NRAS和KRAS基因突变检测，结果显示，良性和恶性患者的RAS基因突变率分别为31%和62%，大多数样本突变等位基因的比率小于50%。且该研究表明，焦磷酸测序技术可作为区分良性与恶性甲状腺肿瘤的辅助手段，对于临床上甲状腺癌的诊断和治疗，可发挥重要作用。

在韩国，通过评价BRAF V600E突变，可以诊断乳头状甲状腺癌症。现已有很多方法可用来检测BRAF V600E突变，如直接测序法、等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）、实时荧光定量PCR、焦磷酸测序技术等。直接测序法作为标准方法，但是需要PCR，需要染料纯化，灵敏度低；AS-PCR简单快速，但是需要电泳辅助，可能会导致污染，且电泳条带很弱时很难读取。Kang等［24］应用PNA-clamping PCR、实时荧光定量PCR和焦磷酸测序技术等3种方法检测100例乳头状甲状腺癌症患者石蜡包埋组织的BRAF V600E突变，并探讨此突变对患者疾病诊断和预后的影响。结果，PNA-clamping PCR、实时荧光定量PCR和焦磷酸测序技术的检测阳性率分别为66%、70%和68%，特异性分别是0.5%、1%和1%；且发现，BRAF V600E突变与癌症的进程和不良预后因子相关，约30%具有此突变的患者其突变低于6%。该研究表明，焦磷酸测序技术可与实时荧光PCR和PNA-clamping PCR一样用于检测BRAF V600F突变，并是一种可以快速、灵敏地检测BRA V600E突变的方法，它的应用对于临床上乳头状甲状腺癌症的诊断和预后评估、进而选用合适的治疗方案具有重要意义。

2.3 用于白血病诊断的基因突变检测

急性髓性白血病（acute myelocytic leukemia，AML）是由于髓系造血干细胞发生积累性的获得性基因突变，进而造成细胞增殖、分化和凋亡途径发生改变的一种恶性疾病。NRAS基因突变是AML病例最常检测出的髓系来源异常之一，其突变会产生一个具有稳定活性的NRAS蛋白，此蛋白不受细胞增殖和凋亡的控制，目前已发现NRAS基因突变与AML有关。Jeong等［25］检测分析了成人AML患者的NRAS基因突变，并将焦磷酸测序技术和直接测序法对NRAS基因突变的检测结果进行对比，其间共检测分析了来自于83名成人AML患者的90个骨髓样本的NRAS基因12、13和61号密码子突变情况。结果，突变检出率达7.2%，并发现，具有NRAS基因突变的患者其血红蛋白水平和FLT3突变发生率均明显较高，其中，3例突变发生在12号外显子，2例突变发生在13号外显子，1例突变发生在61号外显子，但所有突变在治疗期间都消失了；此外，用焦磷酸测序方法进行检测后，再用直接测序法进行确证，发现两者数据基本一致。提示，NRAS基因突变和治疗反应、疾病进程有明显相关性，说明其在临床上的重要性，而焦磷酸测序技术能够实现对基因突变的简单、快速、高通量检测，且无需电泳辅助，所提供的定量数据对于监测与诊断病情发展及治疗情况具有重要意义。

Gebauer等［26］应用焦磷酸测序技术检测14位华氏巨球蛋白血症患者和10位多发性骨髓瘤患者的MYD88基因突变情况时发现，有78.6%（11/14）的华氏巨球蛋白血症患者检测出MYD88 p.L265P突变。为了验证此检测结果，该研究团队用Sanger方法对照比较，结果表明，与其他方法相比，焦磷酸测序技术提供了一种快速、可靠、高灵敏、经济实惠的用于检测福尔马林固定或者石蜡包埋组织中MYD88 p.L265P突变的方法；且由于此技术可以量化等位基因，所以其还可有效用于后续的疾病诊断与监测。

3 小结与展望

目前，基因突变检测常采用的测序技术有Sanger测序法、焦磷酸测序技术、高通量测序技术等。Sanger

测序法广泛应用于人类基因领域的科研工作，并获得了以精确完成人类基因组序列检测为代表的诸多成果［27］。该法以DNA单链为模板，在DNA聚合酶的作用下，模板特异性引物根据碱基互补配对原则将4种dNTP和经不同颜色染料标记的双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）加到引物的3’-羟基末端，并使引物链得到延伸或使其延伸过程终止，得到各种连续长度的DNA片段；然后，经过电泳分离，应用激光诱发荧光法，可以检测到各个片段末端的碱基种类。Sanger测序方法的优点在于，作为目前的金标准测序方法，可以检测几乎所有的基因突变。但其缺点是定量性能差，在检测个别基因突变时，灵敏度不佳，耗时长，步骤多，费用高，工作量较大，适合大规模测序而不适合测定单碱基差异。此外，Sanger测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所占的比例很少，将直接作为背景噪音而很难检测出来，因此，应用于基因突变检测时，其最低检测灵敏度为10%左右，而检测低于10%的突变时，其检测误差极大。高通量测序法的检测灵敏度则可高达1‰，但其检测成本高，用时长，使其应用受到限制。焦磷酸测序技术是一项高通量、低成本、自动化程度高的测序技术，在检测基因突变时，最低检测灵敏度可达2%。此技术无须凝胶电泳辅助，无须对样品进行特殊的标记和染色处理，省时省力，操作简单，结果直观易懂，检测过程耗时短，非常适用于对大量样本的快速检测。目前，焦磷酸测序技术已经成为分析研究基因突变的重要手段，并广泛应用于临床多种疾病的诊断和治疗过程中，在检测基因突变时，具有Sanger测序法和高通量测序法无法比拟的独特优势，检测灵敏度高于Sanger测序法，比高通量测序法成本低、耗时短。而且，焦磷酸测序技术还广泛应用于遗传分析学、SNP分型分析、分子诊断、细菌与病毒的分型分析、甲基化分析等。相信，随着现代科技水平的不断提高，焦磷酸测序技术也必将不断进步、完善，并受到越来越多的关注。

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［专家介绍］ 宋沁馨：副教授，博士生导师。江苏省药学会药物基因组委员会委员，江苏省青蓝工程培养对象。新西兰奥克兰大学、新西兰维多利亚大学、日本日立中央研究所访问学者，科技部中新科学家交流计划成员。主持国家及省自然基金、省社会发展项目、国家重大专项子课题等十余项。获教育部科技进步一等奖、江苏省科技进步三等奖、云南省科技进步一等奖、南京市优秀论文奖等。发表论文50余篇，主编英文专著1部，副主编中文专著2部，参编著作9部。

Research Progress in Application of Gene Mutation Detection by Pyrosequencing Technique in Precision Medicine

LI Jingxuan1，2， JIN Yiru1，2， XU yinqiu1，2， SONG Qinxin1，2， ZHOU Guohua3
（1. Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance of Ministry of Education， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009，China； 2. Department of Pharmaceutical Analysis， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China； 3. Department of Pharmacology，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command， Nanjing 210002， China）

Gene mutation detection has great significance in early diagnosis， individual medication guidance and monitoring of treatment response and drug resistance. With the continuous development of sequencing technology， DNA mutation detection has provided important

for individualized diagnosis and treatment of the diseases such as viral infections， blood diseases and solid tumors. Pyrosequencing is a real-time DNA sequencing technology based on pyrophosphate （PPi） detection by bioluminescent method without the need of electrophoresis and fluorescence labeling for DNA sequencing. It is characterized by high quantitative performance， accurate analysis and easy automation. Pyrosequencing provides a reliable method to detect gene mutation which is useful in disease diagnosis and treatment. The research progress in application of gene mutation detection by pyrosequencing technique in molecular targeting for individualized treatment and disease diagnosis was reviewed.

pyrosequencing； gene mutation； individualized treatment； disease diagnosis

Q523

A

1001-5094（2015）12-0889-07

接受日期：2015-11-04

项目资助：江苏省基础研究计划（自然科学基金）项目（No. BK20151445）；中国博士后科学基金（No. 2012M512179，2013T60962）；中央高校基本科研业务费重点项目（No. 2015ZD008）；药物质量与安全预警教育部重点实验室资助项目（No. DQCP2015MS02）；国家基础科学人才培养基金项目（No. J1030830）；江苏高校优势学科建设工程资助项目；江苏省青蓝工程项目

*通讯作者：宋沁馨，副教授，博士生导师；

研究方向：药物基因组学，临床药物分析，分子诊断新技术；

Tel：025-80860196；E-mail: songqinxin@cpu.edu.cn