miR-375靶向调控人矮小同源盒基因2基因在人食管鳞状细胞癌中的表达

金 立，易 俊，何贞月，宋海珠

0 引 言

食管癌是八大常见肿瘤之一［1］，其发病率居我国恶性肿瘤的第4位，病死率居全部恶性肿瘤的第6位［2］，有2种病理类型:鳞状细胞癌(简称鳞癌)和腺癌［3-4］。在东南亚地区，超过90%的食管癌为鳞状细胞癌，食管鳞癌也是东亚地区最致命的肿瘤之一［5-6］。

人矮小同源盒基因2(short stature homobox 2，SHOX2)是同源异型家族的一个组成成员，约10000bp左右，位于人3号染色体长臂上，共包含10个CpG岛［7］。SHOX2基因在胚胎时期表达于中胚层和外胚层，对骨骼、心脏和神经系统的发育起着重要作用［8］。近年来一些学者发现SHOX2基因的表达变化与肿瘤的发生关系密切。在非小细胞肺癌和乳腺癌中，SHOX2高表达可能预示患者预后不良［9-10］。而在胃癌中，SHOX2高表达可能是由于STAT3激活所致［11］。随着研究的深入，SHOX2在多种肿瘤中的致癌作用机制已逐渐阐明，但在食管鳞癌方面，SHOX2的作用仍不清楚。

本研究采用软件预测，荧光素酶活性分析，通过转染mimics和inhibitor于食管鳞癌细胞，实时定量PCR检测等方法证实miR-375在食管鳞癌细胞EC9706中靶向调控SHOX2基因的表达，为进一步研究SHOX2基因在食管鳞癌中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人食管鳞癌细胞EC9706，人正常食管上皮细胞购自上海复旦细胞库;人食管鳞癌组织，为我院心胸外科手术后病理保存标本。感受态大肠埃希菌 DH5α，Lipofectamine 2000转染试剂，miR-375 mimics购自上海吉凯公司;质粒 pmiR，pSHOX2-375-WT，pSHOX2-375-mut由上海吉玛公司合成;双荧光报告基因检测试剂盒购自Promega公司;XhoⅠ酶、NotⅠ酶购自Fermentas公司;凝胶回收试剂盒购自BioFlux公司;DNA ligation kit购自TOYOBO公司;PCR试剂盒购于 abm公司;用于Western blot的抗体均购于abcam公司。

1.2 预测miR-375和SHOX2基因的可能作用位点 运用生物信息学预测软件TargetScan、miRanda、PicTar、miRTarget2和PITA按照软件操作流程预测miR-375和SHOX2基因可能的作用位点。

1.3 体外实验验证SHOX2基因表达的靶向调控

1.3.1 SHOX2基因3'UTR区克隆及报告基因系统质粒构建 取对数生长期细胞，Trizol法提取总RNA，紫外分光光度仪检测所提取的总RNA浓度。取总RNA，用RT-PCR试剂盒(abm)逆转录为cDNA。qPCR引物由上海吉玛公司设计并合成:SHOX2 F(SacⅠ):ATGAGCTCATTTCCCCCTCTCTATC;SHOX2 R(HindⅢ):ATAAGCTTCAAAGCTCAACCGCATAC。运用 2×Taq PCR MasterMix(abm)20 μL体系进行PCR扩增，优化后的反应条件为:2×MasterMix 12μL ，cDNA 2μL，上游引物0.6 μL ，下游引物0.6 μL，ddH2O 4.8 μL，95 ℃ 变性 5 min，开始1个循环，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环。将PCR产物回收，分别用XhoⅠ、NotⅠ双酶切处理，然后与经双酶切处理后的载体连接，构建成突变Vector 2个重组质粒载体，分别转化感受态大肠埃希菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒，测序鉴定。

1.3.2 细胞转染与Luciferase实验步骤 共有3个质粒，分别是:pmiR，pSHOX2-375-WT，pSHOX2-375-mut;2个micro-RNA，分别是miR-375，miR-NC。分为7组:pmiR组，pSHOX2-375-WT组，pSHOX2-375-WT+miR-375组，pSHOX2-375-WT+miR-NC组，pSHOX2-375-mut组，pSHOX2-375-mut+miR-375组，pSHOX2-375-mut+miR-NC组。

将Roche X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent，质粒，miR-375 和 serum-free DMEM medium放置于室温中，于平行的7个EP管中分别加入300μL的serum-free DMEM medium，分别加入每组质粒和miR，混匀。在7个EP管中分别加入18 μL DNA:Transfection Reagent(1∶2)，混匀。用掌上离心机瞬时离心，静置20min。将1mL 0.25%Trypsin 0.05%EDTA细胞消化液均匀滴加在EC9706细胞表面。37℃放置1 min后，加入5 mL含有10%FBS的DMEM终止消化。离心，取出上清，加入8 mL含有20%FBS的DMEM，计数。

轻轻加入300 μL细胞悬液于7个EP管中，每孔加入100 μL细胞和转染复合物的混合液。培养箱中培养24 h。用检测试剂盒Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega cat.no.E2920)。将 1 瓶Dual-Glo Luciferase Buffer加入到装有Dual-Glo Luciferase Substrate的瓶子中，每孔加入75 μL Dual-Glo Luciferase Reagent，震荡混匀，静置15min，读板。重复读板3次。加入2.4 mL Dual-Glo Stop＆Glo Buffer，然后加入24 μL的 Dual-Glo Stop ＆ Glo Substrate(Dual-Glo Stop＆Glo Substrate:Dual-Glo Stop＆Glo Buffer=1:100)得到Dual-Glo Stop＆Glo Reagent，混匀。取 96孔板，每孔加入 75 μL Dual-Glo Stop ＆ Glo Reagent，震荡混匀，静置 15 min，重复读板3次，导出实验结果。

1.3.3 RNA提取和qPCR分析 总RNA通过Trizol试剂提取，提取过程遵循试剂说明书进行。提取后的总RNA使用逆转录试剂盒逆转录成cDNA保存于-20℃，用于后续qPCR。SHOX2和miR-375的相对表达量通过STEP ONE RT-PCR仪器以SYBR Green法，以GAPDH为内参进行荧光采集分析。

1.3.4 Western blot检测 总蛋白通过 RIPA裂解液获得，并保存于-20℃温度下。凝胶电泳使用10%的SDS电泳液、湿转液将蛋白转移到PVDF膜上。然后经过5%的脱脂牛奶室温下封闭2 h，加SHOX2抗体 4℃孵育过夜，荧光兔抗标记，以GAPDH为内参进行曝光分析。

1.3.5 细胞免疫组化染色 将9706细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5 d后4%多聚甲醛固定，空气干燥，0.5%Triton X-100 孵育 20 min，3%H2O2孵育15 min，封闭血清孵育20 min。一抗孵育4℃过夜，二抗37℃孵育30 min。DAB避光显色，苏木精复染，树胶封固。

1.4 统计学分析 应用SPSS 19.0软件进行统计分析，定量资料采用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差(One-Way ANOVA)分析，组间两两比较方差齐同采用LSD-t检验进行分析，方差不齐时采用Tamhane's T2检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生物信息学预测 生物信息学预测软件TargetScan、miRanda、PicTar、miRTarget2 和 PITA 预测结果显示:miRNA-375在SHOX2 3'UTR1156-1170 bp间有且仅有1个保守结合位点。见图1。

2.2 质粒测序 pSHOX2-375-WT Vector，pSHOX2-375-mut Vector重组质粒测序显示:克隆到pmiR载体上的序列与目标序列完全一致，不存在点突变。见图2。

2.3 荧光素酶活性分析 Luciferase测定结果显示:pSHOX2-375-WT+miR-375组荧光素酶活性(0.261±0.036)显著低于其余 6组［pmiR 组(1.818 ± 0.061)、pSHOX2-375-WT 组(1.820 ±0.086)、pSHOX2-375-WT+miR-NC 组(1.851 ±0.094)、pSHOX2-375-mut组 (1.861 ± 0.059)、pSHOX2-375-mut+miR-375 组(1.896 ±0.048)和pSHOX2-375-mut+miR-NC 组(1.760 ±0.062)］，差异均有统计学意义(P＜0.01);而其余6组间差异无统计学意义(P＞0.05)。

图1 预测靶点及miR-375结合SHOX2 3'UTR位点Figure 1 Target of prediction and miR-375 in combination with the SHOX2 3'UTR site

图2 重组质粒测序结果Figure 2 Sequence of the recombinant plasmid

2.4 qPCR分析与Western blot检测 转染miR-375于食管鳞癌细胞EC9706后，SHOX2 mRNA和蛋白表达量低于转染miR-NC的细胞(P＜0.05)。见图3。

图3 过表达miR-375后SHOX2 mRNA和蛋白表达Figure 3 Expressions of SHOX2 mRNA and protein when miR-375 was overexpressed in the EC9706 cells

2.5 细胞免疫组化染色 转染miR-375于EC9706细胞后行细胞免疫组化染色分析。过表达miR-375组SHOX2表达呈阴性;而转染 miR-NC细胞的SHOX2表达呈阳性。见图4。

图4 镜下观察EC9706细胞内过表达miR-375后SHOX2细胞染色结果(免疫组化染色 ×200)Figure 4 Microscopic observation of SHOX2 when miR-375 was overexpressed in the EC9706 cells(IHC×200)

2.6 组织病理标本检测 分析2例人体食管鳞癌术后病理标本的miR-375与SHOX2检测。食管鳞癌组织中的miR-375较癌旁组织相比表达降低，而SHOX2表达较癌旁组织表达增强(P＜0.05)。见图5。

图5 食管鳞癌组织和癌旁组织标本中的mRNA和蛋白表达情况Figure 5 SHOX2 mRNA and protein expressions in the esophageal squamous carcinoma tissues and normal esophageal tissues

3 讨 论

食管癌根治主要依靠外科手术［6，12］，但其早期诊断率不高，往往直到肿瘤进展到晚期阶段才被确诊［13-14］，从而失去手术机会，而食管鳞癌对于化疗的敏感性不高，因此积极寻找食管鳞癌的早期诊断方法，对于提高食管鳞癌的整体治愈率具有特殊的重要性和紧迫性［15-20］。

最近的研究显示，miR-375表达下调与非小细胞肺癌的增殖和活跃程度相关［19］，而高表达miR-375的小细胞肺癌患者则提示可能预后较差和生存期较短［21］。在妇科肿瘤方面，miR-375在宫颈癌、子宫内膜癌和乳腺癌中表达水平的降低，被视为预后不良的标志［22］。另有研究发现miR-375可抑制胃癌细胞的体外侵袭和转移能力，miR-375同样可抑制原发性肝癌的复发和转移［23］。之前有文献报道miR-375在食管腺癌的患者中表达水平降低［24］，但是miR-375能否对下游SHOX2基因表达进行靶向调节，以及其在食管鳞癌中的作用及分子机制未见报道。

SHOX2是SHOX的同源基因，是同源异型家族的一个成员，位于人3号染色体长臂上，约10000 bp［7］，有SHOX2a、SHOX2b、SHOX2c 3个亚型。主要功能为在脊椎动物的胚胎形成时期进行转录调节。大量研究报道SHOX2的表达改变会影响早期的骨骼和神经系统的发育，而SHOX2甲基化则在多种肿瘤发生早期可以起到预测作用［25］。在肝癌发生过程中，SHOX2的高表达将增强体外肝癌细胞的侵袭和增殖能力，过表达的SHOX2会促进肝癌细胞的生长，抑制SHOX2表达后，肿瘤细胞生长也相应收到抑制［26］。在一些未被确诊为肺癌，却早期出现的胸膜渗出的病例，SHOX2出现高表达的情况下，随后都被确诊为肺癌。这提示SHOX2的高表达或许能作为肺癌胸膜腔渗出的指示性标志物［27］。虽然大量的研究证实SHOX2可视为多种肿瘤的致癌基因，但是其在食管鳞癌的具体调控机制仍不明确。

我们运用5个生物信息学预测软件TargetScan、miRanda、PicTar、miRTarget2 和 PITA 对 miR-375 在SHOX2上可能的作用靶点进行预测，结果显示:miRNA-375在SHOX2 3'UTR1156-1170 bp间有且仅有1个保守结合位点。我们将此位点进行基因突变处理，体外细胞荧光素酶报告基因实验检测miRNA-375对突变前后SHOX2基因表达的影响。结果显示:SHOX2野生型与miR-375结合后萤光素酶活性显著低于其他处理组和对照组，提示miRNA-375对SHOX2基因有抑制作用。随后我们转染miR-375的mimics于EC9706并分别测定SHOX的mRNA和蛋白表达。结果显示miR-375过表达后EC9706的SHOX2 mRNA和蛋白表达水平都受到抑制，这可能预示食管鳞癌细胞中，SHOX2为受miR-375调控的下游靶基因，miR-375可以靶向负调控SHOX2基因的表达;随后细胞免疫组化染色过表达 miR-375，EC9706细胞SHOX2表达呈阴性提示:SHOX2表达可能与miR-375表达相关。提示食管鳞癌组织中SHOX2的表达增强可能与miR-375的表达改变相关。最后，人体食管鳞癌术后病理标本的miR-375与SHOX2检测分析发现:高表达的miR-375癌旁组织中，SHOX2表达要显著低于食管鳞癌组织中的SHOX2表达。上述结果提示:SHOX2的表达受miR-375调控，并且食管鳞癌的发生发展可能是由于miR-375以及SHOX2表达水平改变参与调控等一系列结果所致。

本研究采用生物学预测及体内外实验证实的方法，初步证实了在食管鳞癌，miRNA-375可以靶向负调控SHOX2基因的表达。

［1］ 万岱维，何宋兵，汪 良.微小RNA在结肠癌中的研究进展［J］.医学研究生学报，2013，26(4):421-424.

［2］ Enzinger PC，Mayer RJ.Esophageal cancer［J］.New Engl J Med，2003，349(23):2241-2252.

［3］ Zhang C，Wang C，Chen X，et al.Expression profile of microRNAs in serum:a fingerprint for esophageal squamous cell carcinoma［J］.Clin Chem，2010，56(12):1871-1879.

［4］ Hu A，Huang JJ，Xu WH，et al.miR-21 and miR-375 microRNAs as candidate diagnostic biomarkers in squamous cell carcinoma of the larynx:association with patient survival［J］.Am J Transl Res，2014，6(5):604-613.

［5］ He XX，Kuang SZ，Liao JZ，et al.The regulation of microRNA expression by DNA methylation in hepatocellular carcinoma［J］.Mol Biosyst，2014，26:26.

［6］ Kimura S，Naganuma S，Susuki D，et al.Expression of microRNAs in squamous cell carcinoma of human head and neck and the esophagus:miR-205 and miR-21 are specific markers for HNSCC and ESCC［J］.Oncol Rep，2010，23(6):1625-1633.

［7］ Liu H，Chen CH，Ye W，et al.Phosphorylation of Shox2 is required for its function to control sinoatrial node formation［J］.J Am Heart Assoc，2014，3(3):e000796.

［8］ Sun C，Yu D，Ye W，et al.The short stature homeobox 2(Shox2)-bone morphogenetic protein(BMP)pathway regulates dorsal mesenchymal protrusion development and its temporary function as a pacemaker during cardiogenesis［J］.J Biol Chem，2015，290(4):2007-2023.

［9］ Song L，Yu H，Li Y.Diagnosis of lung cancer by SHOX2 gene methylation assay［J］.Mol Diagn Ther，2015，19(3):159-167.

［10］ Hong S，Noh H，Teng Y，et al.SHOX2 is a direct miR-375 target and a novel epithelial-to-mesenchymal transition inducer in breast cancer cells［J］.Neoplasia，2014，16(4):279-290.

［11］ Zhao J，Dong Y，Kang W，et al.Helicobacter pylori-induced STAT3 activation and signalling network in gastric cancer［J］.Oncoscience，2014，1(6):468-475.

［12］ Feber A，Xi L，Pennathur A，et al.MicroRNA prognostic signature for nodal metastases and survival in esophageal adenocarcinoma［J］.Ann Thorac Surg，2011，91(5):1523-1530.

［13］ Bin H，Bangliang Y，Baoxiang W.MicroRNAs in esophageal cancer［J］.Mol Med Rep，2012，6(3):459-465.

［14］ 蒋 平，宋 丹，房振羽，等.食管癌术后局部复发再次治疗的疗效观察［J］.医学研究生学报，2013，26(12):1275-1278.

［15］ 张 雷，强 勇，易 俊，等.微卫星序列不稳定性与食管癌发病风险的相关性研究［J］.医学研究生学报，2013，26(10):1056-1060.

［16］ 董国华，许 飚，姚 圣，等.食管癌放疗后手术切除116例临床分析［J］.医学研究生学报，2013，26(9):948-951.

［17］ Bier H.Current research in head and neck cancer:molecular pathways，novel therapeutic targets，and prognostic factors［M］.New York:S Karger AG，2005:0065-3071.

［18］ 陈 静，周 园，郑 磊，等.慢病毒载体构建稳定的maspin表达敲减食管癌细胞株［J］.医学研究生学报，2014，27(2):138-142.

［19］ Li H，Shang H，Shu D，et al.gga-miR-375 plays a key role in tumorigenesis post subgroup J avian leukosis virus infection［J］.PLoS One，2014，9(4):e90878.

［20］ Isozaki Y，Hoshino I，Akutsu Y，et al.Screening of alternative drugs to the tumor suppressor miR-375 in esophageal squamous cell carcinoma using the connectivity map［J］.Oncology，2014，87:351-363.

［21］ Yoda S，Soejima K，Hamamoto J，et al.Claudin-1 is a novel target of miR-375 in non-small-cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2014，85(3):366-372.

［22］ Li H，Ji J，Xie Q，et al.Aberrant expression of liver microRNA in chickens infected with subgroup J avian leukosis virus［J］.Virus Res，2012，169:268-271.

［23］ Shen ZY，Zhang ZZ，Liu H，et al.miR-375 inhibits the proliferation of gastric cancer cells by repressing ERBB2 expression［J］.Exp Ther Med，2014，7(6):1757-1761.

［24］ Luo J，Wu J，Li Z，et al.miR-375 suppresses IGF1R expression and contributes to inhibition of cell progression in laryngeal squamous cell carcinoma［J］.Biomed Res Int，2014，374598(10):1471-2407.

［25］ Ilse P，Biesterfeld S，Pomjanski N，et al.Analysis of SHOX2 methylation as an aid to cytology in lung cancer diagnosis［J］.Cancer Genom Proteom，2014，11(5):251-258.

［26］ Yang T，Zhang H，Cai SY，et al.Elevated SHOX2 expression is associated with tumor recurrence of hepatocellular carcinoma［J］.Ann Surg Oncol，2013，20(3):013-3132.

［27］ Dietrich D，Jung M，Puetzer S，et al.Diagnostic and prognostic value of SHOX2 and SEPT9 DNA methylation and cytology in benign，paramalignant and malignant pleural effusions［J］.PLoS One，2013，8(12):e84225.