低温对黄瓜CBF1沉默植株糖含量和酶活性的影响

戴忠仁，李 丹，蒋欣梅，于锡宏*

（1.东北农业大学园艺学院，农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，哈尔滨 150030；2.哈尔滨市农业科学院，哈尔滨 150029；3.辽阳市农林科学院，辽宁 辽阳 111000）

低温对黄瓜CBF1沉默植株糖含量和酶活性的影响

戴忠仁1,2，李 丹3，蒋欣梅1，于锡宏1*

（1.东北农业大学园艺学院，农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，哈尔滨 150030；2.哈尔滨市农业科学院，哈尔滨 150029；3.辽阳市农林科学院，辽宁 辽阳 111000）

研究以农杆菌浸染方法获得的黄瓜CBF1基因沉默植株为试验材料，以常温和低温胁迫下非基因沉默植株为对照，研究低温胁迫对其可溶性糖、蔗糖、葡萄糖和果糖含量及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性影响。结果表明，基因沉默植株可溶性糖、蔗糖、葡萄糖和果糖含量均高于常温下正常植株，但明显低于冷胁迫下的正常植株；超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性则低于冷胁迫和常温下正常植株。基因沉默植株低温胁迫受害程度大于正常植株，即基因沉默植株耐低温性明显弱于正常植株。

低温胁迫；黄瓜；基因沉默；糖含量；酶活性

网络出版时间2015-4-30 14:32:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150430.1432.007.html

戴忠仁,李丹,蒋欣梅,等.低温对黄瓜CBF1沉默植株糖含量和酶活性的影响[J].东北农业大学学报,2015,46(5):10-15.

Dai Zhongren,Li Dan,Jiang Xinmei,et al.Effect of low temperature on sugar and enzymatic activity in cucumber silencing CBF1 gene[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(5):10-15.(in Chinese with English abstract)

温度是植物自然地理分布和产量形成主要限制因素，也是作物生长发育的必要条件之一[1]。黄瓜（Cucumis sativus L.）是我国设施栽培及露地生产中重要蔬菜种类之一。作为反季节冬春设施生产主栽蔬菜之一，低温冷害已成为黄瓜正常生长主要限制因子。

冷害机制是多种因素相互联系相互影响结果。揭示黄瓜耐冷机制首先要了解其冷害机理，逯明辉等、张明科等和隽加香等对植物耐冷性进行研究[2-4]，刁艳研究外源物质对低温胁迫植株的影响[5]，鲍宁宇研究水分胁迫对黄瓜耐冷性的影响[6]，宁宇利用分子技术对黄瓜耐冷性进行研究[7]。

由于黄瓜冷害涉及到的生理生化代谢过程复杂，黄瓜冷害机理和耐冷机制研究虽取得一定进展，但黄瓜耐冷相关基因分离克隆研究较少，生物学功能尚不清楚；且对参加低温信号转导组分与黄瓜耐冷性之间关系缺少足够探讨。

本研究以黄瓜为试验材料，通过对冷胁迫下CBF1基因沉默植株体内与耐冷性相关的代谢机制进行系统分析，了解植物低温胁迫反应生理机制，旨在为黄瓜低温胁迫下的调控技术和耐冷栽培奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

选用黄瓜品种‘Y081’，用于构建和培养CBF1基因沉默的无菌苗。

1.1.2 药剂和菌株

T4连接酶购于Promega公司，限制性内切酶购于TaKaRa公司，DNA片段回收试剂盒、Tet、Rif、Genta、Kan、MES、AS、质粒回收试剂盒购于天根生物工程公司，其他试剂均为国产分析纯试剂。农杆菌菌株GV3101（含辅助质粒pJIC SA_ Rep），四环素选择标记；马铃薯X病毒载体（Pota⁃to virus X，PVX）pgR107，卡那霉素选择标记。

1.1.3 培养基

LB培养基:氯化钠（NaCl）10 g·L-1，胰蛋白胨（Tryptone）10 g·L-1，酵母提取物（Yeast extract）5 g·L-1，琼脂粉15 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 无菌苗培养

将籽料饱满的‘Y081’黄瓜种子先用70%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗2～3次，然后用0.1%升汞进行浸泡，时间为8 min，再用无菌水漂洗3～5次，期间不停震荡，无菌条件下接种种子，置于28℃恒温光照培养箱内暗培养2～3 d，置于温度（26± 0.5）℃，光强2 000 lx，光照时间16 h·d-1培养条件下培养10 d。将生成的无菌苗移栽到营养钵中，转到温度为（22±0.5）℃/（15±0.5）℃（昼/夜），光照时间为12 h，光照强度为4 000 lx条件下的人工气候箱中生长，选择适宜苗龄黄瓜幼苗为重组的马铃薯X病毒载体侵染材料。

1.2.2 农杆菌感受态细胞的制备

将农杆菌划线培养在LB固体培养基上，暗培养至长出菌落。挑取单菌落，接种于液体培养基中振荡培养过夜。取上述菌液，接种于准备好的LB液体培养基中，振荡培养5～6 h，至OD600为0.5。菌液冰浴后，于5 000 r·min-1离心5 min。弃上清，用预冷的CaCl2重悬菌体，5 000 r·min-1离心5 min。再弃上清，菌体沉淀用预冷的CaCl2重悬。储存于-70℃冰柜保存备用。

1.2.3 农杆菌菌液的制备

用接菌环挑取单菌落，接种在LB液体培养基中，暗培养12 h。取过夜培养菌液接种到新鲜LB液体培养基。200 r·min-1摇菌，测定OD值为1.0时，取出菌液，6 000 r·min-1离心5 min，弃上清。等体积重悬，室温静止放置2～3 h后即可接种。

1.2.4 冻融法转化农杆菌

将构建的载体质粒加入农杆菌感受态细胞中，慢慢混匀，冰浴5 min，然后加入LB液体培养基，轻摇2～4 h，消除感受态。6 000 r·min-1离心5 min，倒去上清液，加入新鲜无抗生素LB液体培养基，重新悬浮菌体。将菌液均匀涂布在含有适当抗生素的LB固体培养基上，倒置培养48～96 h。

1.2.5 载体构建

首先根据CBF1基因编码区354～706 bp cDNA序列，设计带有相应酶切位点引物（正向引物带有酶切位点ClaⅠ，反向引物带有酶切位点SalⅠ）。以黄瓜cDNA为模板，PCR扩增目的片段，将胶回收以后克隆到pMD18-T载体上，测序验证正确后，进行双酶切定向克隆在PVX载体ClaⅠ和SalⅠ多克隆位点，构建pgR107-CBF1，如图1所示。

图1 重组病毒载体pgR107-CBF1的构建Fig.1 Construction of pgR107-CBF1 recombinant virus vector

PCR扩增反应采用25 μL体积，反应体系、反应程序和连接反应体系见表1～3。

表1 载体构建PCR扩增反应体系Table 1 PCR amplification system of vector construction

表2 载体构建PCR扩增反应程序Table 2 PCR amplification procedure of vector construction

表3 载体构建连接反应体系Table 3 Ligation system of vector construction

1.2.6 农杆菌的侵染

将黄瓜无菌苗转到温度（22.0±0.5）℃/（14.0± 0.5）℃（昼/夜），光照时间12 h，光照强度4 000 lx条件下的人工气候箱中生长，用无菌注射器将农杆菌悬浮液压入叶片叶脉中，接种所有叶片，用含pgR 107空载体的农杆菌侵染植株为对照，分别在接种后5、10、15 d将接种植株置于4℃条件下4 h观察植株表型。

1.2.7 载体pgR107-CBF1转化农杆菌的PCR鉴定

在PVX载体多克隆位点两侧设计引物，检测重组子，无外源片段插入时扩增片段长度约为600 bp。其扩增方法如下：随机挑取平板上长出的白色单菌落，加入到LB液体培养基离心管中震荡培养过夜，然后取1 mL培养物到新离心管中，5 000 r·min-1离心5 min去上清液，加入无菌水混合均匀，沸水中煮20 min，稍离心，取2 μL上清液作为下一步PCR反应的模板，以含PVX空载体的农杆菌菌株作为阴性对照。PCR扩增反应采用25 μL体积，反应体系、反应程序见表4、5。

表4 PCR扩增反应体系Table 4 System of PCR amplification

表5 PCR扩增反应程序Table 5 Procedure of PCR amplification

1.2.8 可溶性糖、蔗糖、葡萄糖、果糖含量和过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性的测定

将基因沉默后的植株置于温度（2.0±0.5）℃/ （14.0±0.5）℃（昼/夜）的条件下预处理1 d，然后将植株置于（10.0±0.5）℃/（5.0±0.5）℃（昼/夜）的光照培养箱中冷胁迫处理3 d，以常温条件下生长的非基因沉默植株为对照1（CK1）、低温胁迫下处理3 d的非基因沉默植株为对照2（CK2），3次重复取平均值。可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法[8]、蔗糖含量测定采用间苯二酚比色法[8]、葡萄糖含量测定采用邻-联茴香胺比色法[10]、果糖含量测定采用间苯二酚比色法[8]、过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚比色法[9]、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑光化还原法[9]、过氧化氢酶（CAT）活性测定采用碘量滴定法[10]。

2 结果与分析

2.1 黄瓜基因沉默植株的表达分析

分别在接种后5、10、15 d将接种植株置于4℃条件下调查CBF1基因的转录水平，结果如图2所示，侵染后10 d的基因沉默植株中CBF1基因的mRNA水平明显减少，而内参基因Actin的表达水平无明显差异，说明CBF1基因表达受到抑制。

图2 黄瓜CBF1基因沉默植株的PCR检测Fig.2 PCR identification of CBF1 gene silencing in cucumber

2.2 低温胁迫对黄瓜沉默植株可溶性糖、蔗糖、葡萄糖和果糖含量的影响

植物体内游离糖类物质是生物体内代谢活动可直接利用的源之一，同时也是增加细胞内浓度，降低生物体冰点，减少胞内结冰，缓冲细胞质过度脱水，保护胞内失水的重要物质之一。

2.2.1 低温胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株可溶性糖含量的影响

低温胁迫下CBF1基因沉默植株与对照株可溶性糖含量变化由图3可知，冷胁迫后对照CK2体内蔗糖含量显著增加，CBF1沉默基因植株体内可溶性糖含量与常温对照CK1相比无显著增加，但显著低于冷胁迫对照CK2，说明CBF1基因可能与黄瓜体内可溶性糖代谢有关。

图3 CBF1沉默对冷胁迫黄瓜可溶性糖含量的影响Fig.3 Effects of cold stress on soluble sugar contents in transgenic cucumber silencing CBF1 gene

2.2.2 低温胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株蔗糖含量的影响

低温胁迫下CBF1沉默植株与对照株蔗糖含量变化由图4可知，冷胁迫后CK2体内蔗糖含量显著增加，而CBF1沉默植株经冷胁迫后蔗糖含量无显著增加，与常温对照CK1相比无明显差异，但显著低于冷胁迫对照CK2，说明CBF1基因可能与黄瓜体内蔗糖代谢有关。

2.2.3 低温胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株葡萄糖含量的影响

低温胁迫下CBF1沉默植株与对照株葡萄糖含量变化由图5可以看出，冷胁迫后对照CK2体内葡萄糖含量显著增加，说明植物体受到低温伤害后体内葡萄糖含量增加，而CBF1沉默植株经冷胁迫后葡萄糖含量无显著增加，与常温对照CK1相比无明显差异，但显著低于CK2。说明CBF1基因可能与黄瓜体内葡萄糖代谢有关。

图4 CBF1沉默对冷胁迫黄瓜蔗糖含量的影响Fig.4 Effects of cold stress on saccharose contents in transgenic cucumber silencing CBF1 gene

图5 CBF1沉默对冷胁迫黄瓜葡萄糖含量的影响Fig.5 Effects of cold stress on glucose contents in transgenic cucumber silencing CBF1 gene

2.2.4 低温胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株果糖含量的影响

低温胁迫下CBF1沉默植株与对照株果糖含量变化由图6可知，对照CK2体内果糖含量最高，对照CK1体内果糖含量最低，说明植物体受到低温胁迫后体内果糖含量增加，而CBF1沉默植株经冷胁迫后体内果糖含量与常温对照CK1相比无显著增加，但显著低于冷胁迫对照CK2，说明CBF1基因可能与黄瓜体内果糖代谢有关。

图6 CBF1沉默对冷胁迫黄瓜果糖含量的影响Fig.6 Effects of cold stress on fructose contents in transgenic cucumber silencing CBF1 gene

2.3 低温胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的影响

过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶在植物体内的酶促系统中具有重要作用，可清除生物体内的自由基O-2和H2O2，是反映植物体体内代谢和抗逆性的主要指标之一。低温胁迫下CBF1沉默植株与对照株过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性变化由图7可知，低温胁迫对照CK2体内超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性高于常温对照CK1，说明植物体受到低温伤害后体内过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性增强，而基因沉默植株在低温胁迫后体内过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性均低于冷胁迫对照CK2和常温对照CK1。说明CBF1基因可能与黄瓜体内过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶代谢有关。

图7 低温胁迫对黄瓜沉默植株相关酶活性的影响Fig.7 Effects of low temperature stress on related enzymatic activity in transgenic cucumber silencingCBF1gene

3 讨论与结论

Gilmour等发现CBF3基因可增加拟南芥中可溶性糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和棉子糖等含量，使其耐寒性增强[11-12]。Ito等发现转OsCBF基因的水稻可溶性糖含量增加[13]。这与本试验结论一致，对相关生理生化指标测定发现，基因沉默植株耐寒性明显低于对照植株，沉默植株正常生理代谢受到抑制，有利于提高植物体耐冷性的渗透调节物质含量无显著增加。此外，CBF1基因与植物体耐冷性增强的关系目前仍不清楚，通过与下游COR系列基因中CRT/DRE的DNA调控元件结合，诱导一系列耐冷基因表达，提高植物耐冷性[14]。

彭永康等研究结果表明，大部分植物细胞酶系在较低温度条件下变得更加稳定，但起源于热带对低温敏感植物，在能够引起冷害的临界低温温度条件下能引起多种酶系统结构、功能或数量等多方面变化。冷胁迫后，植物体内积累的活性氧是植物遭受伤害原因之一，过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶是植物体体内普遍存在的一种与植物体氧代谢过程相关的酶类，这些酶与生物体抗逆性紧密相关，常作为评价植物耐冷性指标。在进行植物冷驯化的研究中，抗寒能力不同的牧草作物苜蓿、粮食作物小麦以及蔬菜作物香瓜在低温驯化过程中，可观察到经过充分冷驯化，其过氧化物酶同工酶发生变化[15-16]。刘鸿先等对黄瓜过氧化物酶同工酶进行研究，结果表明，不同黄瓜品种同工酶存在差异，耐冷性强的黄瓜品种比冷敏感的黄瓜品种多条带[17]。Hsieh等研究认为转拟南芥CBF1基因在番茄植株体内过氧化氢酶活性增强[18]。戴金平等发现，低温锻炼后的黄瓜幼苗经冷胁迫后，过氧化物酶和过氧化氢酶活性较高，可有效减少低温对黄瓜的伤害[19]。而马德华等研究与之相反，研究发现过氧化氢酶和超氧化物歧化酶在冷胁迫后活性下降，且下降率与黄瓜品种耐冷性呈负相关[20]。曹辰兴研究发现10℃/6℃低温胁迫后，黄瓜体内过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性增强，而10℃/ 4℃低温胁迫后，过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性降低[21]。由此可见，黄瓜体内过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性强弱与冷胁迫处理的温度相关，本试验研究发现，经冷胁迫后不同品种黄瓜过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性均增强，与刘鸿先和戴金平等研究结果一致，而与马德华等研究结果相反，可能是由于冷胁迫温度不同，且不同品种之间耐冷性存在差异。本研究同时发现，低温胁迫后植株体内酶活性增强，而基因沉默植株体内酶活性低于低温胁迫植株和常温生长的植株，说明CBF1基因与黄瓜体内酶促系统代谢有关。以反季节主栽的黄瓜品种为试材，利用分子与生理相结合方法研究CBF1基因对植物耐冷性的影响，对生产实践也具有一定指导意义。

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Effect of low temperature on sugar and enzymatic activity in cucumber silencingCBF1 gene

DAI Zhongren1,2,LI Dan3,JIANG Xinmei1,YU Xihong1（1.School ofHorticulture,Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops,Northeast Region,Ministry of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Harbin Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150029,China;3.Liaoyang Academy of Agricultural and Forestry Sciences,Liaoyang Liaoning 111000,China)

Agrobacterium-mediated method was used to obtain transgenic cucumber plants silencing CBF1 gene,and non-transgenic plants in normal temperature and under low temperature were used as the control so as to investigate the effects of low temperature stress on the content of soluble sugar,sucrose, glucose and fructose and enzymatic activities of SOD,POD and CAT.The results showed that soluble sugar,sucrose,glucose and fructose contents of gene silencing cucumber were higher than that of the control under ordinary temperature and lower than that of the control under cold stress obviously.And the activities of SOD,POD and CAT of transgenic cucumber were lower than that of the control under cold stress and ordinary temperature.Under low temperature stress,CBF1 gene silencing plants suffered more damage than normal plant.The results showed that low temperature tolerance ability ofCBF1 gene silencing plants were significantly weaker than that of the control.

low temperature stress;cucumber(Cucumis sativusL.);gene silencing;sugar content; enzymatic activity

S642.2

A

1005-9369（2015）05-0010-06

2015-02-06

哈尔滨市青年科技创新人才项目（2013RFQYJ042）

戴忠仁（1976-），男，高级农艺师，博士研究生，研究方向为蔬菜栽培与生理。E-mail:215353748@qq.com

于锡宏，教授，博士生导师，研究方向为蔬菜栽培与生理。E-mail:yxh100@sohu.com