广西野生稻耐冷性鉴定与遗传纯合研究

郭 辉，陈 灿，张晓丽，秦学毅，冯 锐

(广西农业科学院水稻研究所/广西水稻遗传改良生物技术重点实验室，广西 南宁 530007)



广西野生稻耐冷性鉴定与遗传纯合研究

郭 辉，陈 灿，张晓丽，秦学毅，冯 锐*

(广西农业科学院水稻研究所/广西水稻遗传改良生物技术重点实验室，广西 南宁 530007)

【目的】筛选耐冷性强的野生稻种质，研究野生稻耐冷性遗传的稳定性，为水稻耐冷性育种和研究提供抗源。【方法】利用人工气候箱对收集的广西野生稻资源进行苗期耐冷性鉴定，在桂北高寒山区自然低温条件下进行宿根期耐冷性评价；选择耐冷性较强的材料通过连续套袋自交或花药培养进行耐冷性遗传纯合研究。【结果】筛选出苗期1级耐冷材料广西普通野生稻20份，广西药用野生稻1份，普通野生稻花培株系92份；宿根期3级耐冷材料广西普通野生稻43份，药用野生稻2份，普通野生稻花培株系5份；耐冷性较强的直立或半直立型种质8份；广西普通野生稻苗期和宿根期耐冷性呈极显著正相关(r=0.26)，广西药用野生稻苗期和宿根期耐冷性相关性不显著(r=-0.11)；广西普通野生稻在苗期耐冷性与宿根期耐冷性上，平均耐冷等级均表现为匍匐型耐冷性最强，倾斜型次之，半直立型与直立型间无差异且最弱；来自桂北的野生稻苗期耐冷性最强；来自桂南的野生稻宿根期耐冷性表现最强。【结论】鉴定筛选出的材料可用于耐冷育种及抗逆机理研究。筛选出的材料可用于水稻耐冷性研究和育种，同时可以通过套袋自交与花药培养加快获得耐冷性更强的纯合株系。

普通野生稻；药用野生稻；耐冷性；遗传纯合；

【研究意义】低温是影响水稻生产发育、产量和限制种植面积的重要因素，对水稻生产威胁极大，我国每年因低温冷害损失稻谷30～50亿kg[1]。在高纬度高海拔地区冷害优为严重，而在低纬度低海拔的南方稻区，早造的倒春寒与晚造的寒露风均严重影响水稻产量，甚至失收[2-3]。减少低温对水稻生产的不利影响，选育及推广耐冷性强的品种是防御冷害经济有效的途径之一。广西野生稻资源极为丰富，野生稻作为天然的基因库，蕴藏着无数栽培稻没有或已削弱的特异优良基因[4]，因此挖掘野生稻的耐冷性材料对水稻耐寒育种利用创新具有重要意义。【前人研究进展】耐冷性种质资源的鉴定、筛选与利用是抗寒育种的材料基础[5]，许多研究学者在水稻耐冷鉴定筛选中做了大量工作，获得了一批耐冷性强的优异种质。张建华等[6]在控温条件下从690份中日双方提供的稻种资源中，分别筛选出芽期和苗期极耐冷材料25和14份。戴陆园[7]从2763份云南稻种资源中筛选出芽期耐冷性(1～3级)资源79份，从475份稻种资源中发掘出苗期耐冷性资源5份。韩龙植等[8]从879份水稻种质资源中筛选出芽期耐冷性极强的种质资源39份。夏秀忠等[9]对419份广西水稻地方初级核心种质进行芽期、苗期的耐冷鉴定，筛选出极强耐冷种质分别为24和27份。【本研究切入点】目前对野生稻部分材料耐冷性评价已有相关研究[10-11]，但对广西野生稻苗期与宿根期耐冷的相关性及野生稻耐冷性的遗传纯合的研究较少。【拟解决的关键问题】对广西野生稻及其花培株系进行苗期与宿根期耐冷性鉴定，了解不同野生稻种质的苗期与宿根期耐冷性差异，探讨纯合野生稻的方法，筛选极强耐冷的优异野生稻种质资源，为基础研究及育种利用提供良好的供试材料。

1 材料与方法

1.1 植物材料

本试验材料是在广西46个县148个野生稻分布点收集，试验中广西普通野生稻共鉴定1657份，其中苗期鉴定983份，宿根越冬期鉴定1487份；广西药用野生稻共鉴定199份，其中苗期鉴定98份，宿根越冬期鉴定199份；普通野生稻花培材料共鉴定128份，其中苗期鉴定92份，宿根期鉴定128份；对照分别为耐冷粳稻品种滕坂5号和对冷敏感籼稻品种IR 8。

1.2 耐冷鉴定

1.2.1 苗期耐冷鉴定及分级标准 参照韩龙植和张三元的方法[12]，将浸种催芽的种子播于托盘，待3叶期或3叶1心期时去除小弱苗，置于人工气候箱冷处理，处理条件为温度6 ℃，相对湿度80 %，光照5000 lx，光/暗各12 h循环，连续处理6 d后，置于室内有散光处自然恢复7 d后调查死苗率，死苗率( %)=死苗株数/总株数×100，重复3次。

耐冷评级标准：1级死苗小于10 %(极强)；3级死苗在11 %～30 %(强)；5级死苗在31 %～50 %(中等)；7级死苗在51 %以上(弱)；9级全部死亡(极弱)。

1.2.2 宿根越冬耐寒鉴定及分级标准 宿根越冬采用高寒山区自然低温鉴定，试验点设在广西桂林市龙胜县和全州县，在2000-2006年，于每年7月份移栽种植，越冬前调查野生稻分蘖及生长情况，次年3月份开始调查越冬后野生稻存活及生长状况，按耐冷鉴定分级标准进行评估和统计。

宿根越冬分级标准：整个越冬期共调查3次。第1次在初霜前调查越冬前成活材料数，分3级记载其生长情况，第2次在次年3月上旬，按越冬期耐冷鉴定的5级标准进行，第3次在4月下旬，仍按5级标准调查。耐冷分级采用目测法，其标准为1级：老茎基部及再生苗能越冬，再生苗多，长势好，死苗在20 %以内；3级：大部分(>70 %)老茎基部及再生苗能越冬，再生苗数量及长势中等；5级：大约半数(50 %～70 %)老茎基部能越冬，再生苗较少，长势较弱；7级：少数(50 %以下)老茎基部能越冬，再生苗少，长势弱；9级：老茎基部及再生苗全部枯死。

1.3 野生稻遗传纯合

野生稻多为杂合体，为了便于利用研究，对其进行遗传纯合。选取初筛后耐冷性较好的材料，进行套袋自交，收种后继续进行耐冷性鉴定，再选取耐冷性较强的单株套袋自交收种，如此自交选择3～5代，以期获得耐冷性纯合的株系。

花药培养 参照冯锐等[18]的方法，在野生稻花粉母细胞减数分裂的单核靠边期剪取稻穗，于6～8 ℃条件下预处理6～8 d，小穗在0.1 %升汞溶液中消毒6 min，取花药接种到愈伤组织诱导培养基中进行暗培养，待获得的2 mm大小愈伤组织时，接种于分化培养基上进行分化培养，愈伤组织分化出的绿苗经炼苗、移栽和套袋收种。

诱导培养基配方：N6大量和微量元素+MS有机物+甘氨酸4 mg/L+丙氨酸2 mg/L+水解乳蛋白(LH)400 mg/L+2,4-D 2 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L+蔗糖5 %。

绿苗分化培养基为MS基本培养基+水解酪蛋白(CH)500 mg/L +IAA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+ Kinetin 1.5 mg/L+蔗糖5 %。

图1 广西普通野生稻材料苗期、宿根期耐冷级别分布 Fig.1 Distribution of cold tolerance of the Oryza rufipogon in Guangxi at germinating and seeding stage

1.4 统计分析

试验数据采用Excel、DPS 7.05等软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 广西普通野生稻耐冷性鉴定结果

广西普通野生稻苗期耐冷性鉴定984份，平均耐冷等级5.97级，变异系数30.52 %。多数种质材料集中在5和7级，这2个等级材料占总参试材料的75.10 %，而1、3、9级分别占参试材料的2.03 %、15.14 %、7.72 %(图1)。宿根期耐冷性鉴定1488份，平均耐冷等级6.62级，变异系数21.91 %。其耐冷性分布与苗期耐冷分布相似，以耐冷5级与7级材料较多，但未发现1级耐冷材料，3、5、7、9级材料分别占参试材料的2.89 %、29.03 %、52.49 %、15.59 %(图1)。

对943份广西普通野生稻苗期和宿根期耐冷级别相关性分析表明，两者呈极显著正相关(r=0.26)。从中筛选到耐冷性较强的直立或半直立型种质8份(表1)，其中直立型材料1008苗期耐冷级别为3级，半直立型材料1507苗期耐冷级别达1级，半直立型材料753苗期与宿根期耐冷均为3级。

2.2 广西药用野生稻耐冷性鉴定结果

广西药用野生稻苗期耐冷性鉴定98份，平均耐冷级别4.78级，变异系数30 %，其中5级材料占多数，未发现9级材料，1、3、5、7级材料分别占参试材料的1.02 %、28.57 %、51.02 %、19.39 %。宿根期耐冷性共鉴定198份，平均耐冷级别6.15级，变异系数16.76 %，以5和7级材料占多数，分别占参试材料的40.40 %和58.49 %，3级材料仅2份，占参试材料的3.90 %，未发现1和9级材料(图2)。对97份广西药用野生稻苗期和宿根期耐冷级别相关性分析表明，两者相关性不显著(r=-0.11)。

图2 广西药用野生稻材料苗期、宿根期耐冷级别分布 Fig.2 Distribution of cold tolerance of the Oryza officinalis in Guangxi at germinating and seeding stage

2.3 广西普通野生稻株型之间苗期、宿根期耐冷性的差异分析

广西普通野生稻按生长习性(株型)分为匍匐、倾斜、半直立和直立4个类型，对类型间进行耐冷差异的比较分析。由表2可知，在苗期耐冷性与宿根期耐冷性上，匍匐型材料在平均耐冷级别、变异系数、表现为3级以上耐冷资源比例均最高，苗期的平均耐冷等级为5.65级，变异系数为33.98 %，表现为3级以上耐冷资源占该类型比例为23.83 %；宿根期的平均耐冷等级为6.28级，变异系数为21.02 %，表现为3级以上耐冷资源占该类型比例为3.98 %。在苗期耐冷性与宿根期耐冷性上，平均耐冷等级均表现为匍匐型耐冷性最强，倾斜型次之，半直立型与直立型间无差异且最弱。

表1 耐冷性较强的直立或半直立型种质

表2 广西普通野生稻株型之间苗期、宿根期耐冷性差异比较

2.4 广西野生稻采集地区之间苗期、宿根期耐冷性的差异分析

把广西野生稻的采集地按稻作区分为桂南、桂中、桂北3个区域，由表3可知，广西普通野生稻在苗期耐冷性上，来源于桂北的材料在平均耐冷级别、变异系数、表现为3级以上耐冷资源比例均最高，其中平均耐冷等级为5.17级，变异系数为37.99 %，表现为3级以上耐冷资源占该区域比例为30.99 %。来源于桂中的材料在耐冷性表现最弱，平均耐冷等级为6.40级。广西普通野生稻在宿根期耐冷性上，来源于桂南的材料在平均耐冷级别、变异系数、表现为3级以上耐冷资源比例均最高，其中平均耐冷等级为6.54级，变异系数为22.32 %，表现为3级以上耐冷资源占该区域比例为3.35 %。同样是来源于桂中的材料在耐冷性表现最弱，平均耐冷等级为6.76级。药用野生稻在宿根期耐冷性上，来源于桂南的材料耐冷性表现较强，其中平均耐冷等级为6.01级，变异系数为17.53 %，表现为3级以上耐冷资源占该区域比例为1.30 %。来源于桂中的材料在耐冷性表现较弱，平均耐冷等级为6.64级。

2.5 普通野生稻花药纯合株系耐冷性鉴定结果

普通野生稻多为杂合体，同一编号单株间其农艺性状和抗性存在一定的分离，导致难以育种利用，为得到耐冷性纯合植株，在耐冷鉴定基础上对一些耐冷性较好的材料进行花药培养，对花培植株H2株系进行耐冷鉴定。从表4可知，来源于2个材料的花培后代株系耐冷性与形态特性均已稳定，同一材料后代的花培株系间耐冷性出现分离，但未发现比原耐冷性更强的株系。

对所有的花培株系进行耐冷性鉴定统计，从表5可知，苗期耐冷鉴定92份，平均耐冷级别3.52级，变异系数40.26 %，其中以3级材料占多数，为参试材料的59.78 %，1、5、7级材料分别占参试材料的9.78 %、25 %、5.43 %，未发现9级材料。宿根期耐冷鉴定128份，平均耐冷级别5.02级，变异系数11.73 %,以5级材料最多，其中3、5、7级材料分别占参试材料的3.91 %、91.41 %、4.69 %，未发现1级和9级材料。对92份普通野生稻花培株系苗期耐冷与宿根期耐冷分析表明，两者呈极显著正相关(r=0.41)。

表3 广西野生稻不同采集区域耐冷性差异比较

表4 普通野生稻花培植株耐冷性表现

表5 普通野生稻花培株系耐冷鉴定结果

2.6 普通野生稻自交纯合苗期耐冷性分析

从984份苗期耐冷鉴定的普通野生稻中选出6份有代表性材料进行自交遗传纯合，结果见表6，原平均苗期耐冷1级的材料315、1502，其自交1～2代都有1～3级耐冷分离，经4代套袋自交及选择后苗期耐冷性趋于1级稳定。原平均苗期耐冷3级的材料1008、1085，其自交1～2代都有1～5级耐冷分离，经4代套袋自交及选择后苗期耐冷性基本在1～3级分离。原平均苗期耐冷5级的材料644、1372，其自交1～2代都有3～7级耐冷分离，经4代套袋自交及选择后，材料1372苗期耐冷性趋于稳定，为3级；材料644苗期耐冷性基本为3～5级分离。

3 讨 论

3.1 野生稻苗期和宿根期耐冷性与地理环境关系

曾亚文研究团队[13-14]分析了云南地方稻核心种质孕穗期耐冷性、苗期耐冷性及地理生态差异；张建华等[5]分析了690份中日稻种资源芽期和苗期耐冷性及云南稻种地理分布区域；夏秀忠等[15]对广西水稻核心种质进行稻作区之间芽期、苗期耐冷性差异分析。前人结果[5-8,16-17]表明水稻耐冷性与其来源地海拔和纬度有一定的相关性。本研究结果也表明，来源于广西南部的普通野生稻与药用野生稻资源，宿根期耐冷性均显著高于其它区域的资源，而来源于是广西北部的普通野生稻苗期耐冷性极显著高于其它区域的资源，说明广西野生稻苗期与宿根期耐冷性与地理环境有关。多位学者研究认为，栽培稻种高纬度地区水稻耐冷性优于低纬度地区[5,7,16-17]。本研究结果表明，宿根期耐冷性表现为普通野生稻桂南>桂北>桂中，药用野生稻桂南>桂中，普通野生稻苗期耐冷性表现为桂北>桂南>桂中，这与栽培稻种资源的耐冷性规律有所不同。

表6 普通野生稻自交后代苗期耐冷性表现

3.2 普通野生稻遗传纯合与耐冷性

普通野生稻具有异花授粉特性，从原生地收集的材料资源绝大数是以杂合体形式保存下来，这些材料多数耐冷性水平较低，不能代表其真正的耐冷水平，若直接利用，很难获得具有更强耐冷性的后代，另外对于一些优异的隐性性状也很难发现。因此，对普通野生稻材料先进行遗传纯合后，再对其开发利用具有重要意义。本研究结果表明，经过4代的套袋自交及目标选择后，可能获得耐冷性更强，遗传趋于稳定的野生稻材料；利用花药培养技术，可更快的获得遗传纯合的野生稻材料；这更有利于客观评价野生稻资源，并加快优异资源在基础研究和育种上的利用。而利用同样的方法，在普通野生稻抗褐飞虱方面进行了研究，并获得了一批纯合种质资源[18]。另外，若先对野生稻进行2～3代套袋自交及目标选择，再对优良单株进行花药培养，则可能更快获得耐冷性强的纯合材料。

4 结 论

本研究鉴定筛选出广西野生稻苗期1级耐冷材料共113份，宿根期3级耐冷材料共50份；耐冷性较强的近栽材料8份，这些材料可用于耐冷育种及抗逆机理研究。普通野生稻自身的杂合性，可通过多代套袋自交结合耐冷性选择，获得耐冷性更强性状稳定的株系材料；通过花药培养技术，可快速获得纯合普通野生稻材料。

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(责任编辑 王冠玉)

Study on Cold Tolerance Identification and Genetic Homozygosity of Wild Rice in Guangxi

GUO Hui, CHEN Can, ZHANG Xiao-li, QIN Xue-yi, FENG Rui*

(Rice Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Rice Genetics and Breeding, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007，China)

【Objective】Screening wild rice germplasm resources with strong cold tolerance, and studying their genetic stability would provide resistant sources for rice cold tolerance breeding and research.【Method】Identification of cold tolerance germplasm at seedling stage was carried out to wild rice resources collected from Guangxi in the artificial climate box, and cold tolerance at perennial root stage was evaluated under the circumstances of natural cold at highland cold area lying in the north of Guangxi. We will study genetic purity of cold tolerance germplasms through continuously bagging selfing and anther culture. 【Result】20 common wild rice,1 medicinal wild rice and 92 common wild rice by flower breeding were found, their cold tolerance reach 1 class at seedling stage;some germplasm resources showed cold tolerance to 3 class at perennial root stage, which included 43 common wild rice,2 medicinal wild rice 5 common wild rice by flower breeding; 8 erect type and slighting type germplasm resources showed stronger cold tolerance were found. The study announced at seedling stage and perennial period,the average cold tolerance levels of Guangxi common showed creeping type wild rice had the strongest cold tolerant, next was tilt type rice, and the weakest was Semi-erect type and erect type which had no difference between them. 【Conclusion】These resources of identified and screened would be used for cold resistant breeding and resistant mechanism research. These materials would be used to carry out in breeding utilization and cold tolerance to research. Moreover,this research found that through bagging selfing and anther culture can obtain stronger cold tolerance homozygous lines accelerately.

Oryzarufipogon; Oryzaofficinalis; Cold tolerance; Genetic homozygosis

1001-4829(2017)6-1245-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.001

2017-03-21

国家自然科学基金“药用野生稻对褐飞虱免疫抗性的功能研究与抗性利用”(31560385)；广西自然科学基金项目“普通野生稻抗褐飞虱新基因精细定位及比较转录组学分析”(2015GXNSFAA139060)；广西科技计划项目“野生稻抗褐飞虱基因的挖掘和利用”(桂科AB16380138)；广西科技计划项目“越、老、柬籼型特种水稻种质资源引进与应用”(桂科合15104001-27)；广西农业科学院科技发展基金项目“广西野生稻优异资源的繁殖更新及高抗体材料的遗传纯合”(桂农科2017JM70)

郭 辉(1982-)，男，山西临汾人，硕士，助理研究员，主要从事水稻抗逆资源评价与遗传育种研究工作，E-mail：gh8207@163.com，*为通讯作者，E-mail：fengrui@gxaas.net。

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