四川省3个不同栽培地油橄榄品种皮瓜尔的含油率与遗传差异分析

赵 琦，郭晓强，庄国庆，颜 军，何世勤，李 锐*

(1.成都大学药学与生物工程学院，四川 成都 610106；2.四川省林业科学研究院，四川 成都 610081；3.四川省天源油橄榄有限公司，四川 达州 636251)



四川省3个不同栽培地油橄榄品种皮瓜尔的含油率与遗传差异分析

赵 琦1，郭晓强1，庄国庆2，颜 军1，何世勤3，李 锐1*

(1.成都大学药学与生物工程学院，四川 成都 610106；2.四川省林业科学研究院，四川 成都 610081；3.四川省天源油橄榄有限公司，四川 达州 636251)

【目的】油橄榄是重要的油果兼用经济林木，含油率的高低直接影响到油橄榄品种经济价值。影响含油率因素包括所处生态环境和遗传潜力。【方法】本文以引种到四川省3个不同生态区(达州、金堂和西昌)的油橄榄品种皮瓜尔作为研究对象，首先分析了皮瓜尔原产地(西班牙地区)和引种栽培地(达州、金堂和西昌)的气候特点，结合含油率的测定结果(西昌皮瓜尔含油率最高)，推测日照时数是影响含油率的关键生态因子。随后对克隆到的功能基因编码序列DNA片段进行SNP分析，发掘其中的单核苷酸变异位点和其编码的氨基酸变异位点。【结果】在花青素合酶(Anthocyanidin synthase，ANT)、钙调蛋白(Calcium binding protein，CBP)和查尔酮合酶(Chalcone synthase，CHS)3个基因片段中检测到了SNP，共发现了3个CAPS位点，得到的2种SNP组合(SNP1-HphI/SNP2-EagI和SNP2-EagI/SNP3-BsgI)可以完成对皮瓜尔品种区域性的鉴别。【结论】本研究获得的3个CAPS分子标记实现了对不同区域油橄榄品种皮瓜尔快速、准确的鉴定，今后将加大对该基因功能差异的研究，以期为油橄榄育种研究奠定基础。

油橄榄；含油率；单核苷酸多肽(SNP)；遗传差异

【研究意义】油橄榄(OleaeuropaeaL.)为木犀科(Oleaceae)木犀榄属(Olea)的常绿乔木，是世界四大木本油果兼用(油橄榄、油棕、油茶、椰子)树种之一，该植物原产地主要分布于地中海沿岸国家，中国是其在东亚的主要引种栽培区，四川省是引种油橄榄最早的省份之一[1]。油橄榄果实中所含的橄榄油是世界上唯一可通过鲜果冷榨即可食用的植物油，具有预防心脑血管、癌症等恶性肿瘤的功效，享有“植物油皇后”、“液体黄金”等美称[2]。油橄榄最大的用途是制油，因此如何提高其含油率就成了研究重点，韩华柏等[3]利用逐步回归分析的方法研究了影响油橄榄含油率的关键因子，结果表明，光、温、水等指标综合影响油橄榄的产量和品质。郭翔等基于GIS的生态评价系统则进一步分析了四川油橄榄引种栽培的环境条件，指出油橄榄的含油量、产量和品质与其所处的生态环境密切相关，当前分布区的生境条件与引种区的生境条件越相似，越有利于油橄榄的生长发育[4]。另有研究则指出，对于生长在不同生境条件下的油橄榄，由于生境异质性往往会通过歧化选择或本地适应来导致适应性遗传多样性的发生[5]。从以上油橄榄含油率、产量与环境因子之间的关系研究可以看出，油橄榄所处的生态环境是一个重要的影响因素。【前人研究进展】随着分子生物学的发展，基于分子标记方法不受外界环境因素影响的优点，越来越多的分子标记(如RAPD[6]、SSR[7]、ISSR[8]、SRAP[9]等)被应用于油橄榄的遗传多样性分析，人们可以直接从基因水平研究油橄榄的遗传差异，进而指导油橄榄的筛选与利用，获得高含油率、高品质的油橄榄资源。近年来，基于SNP标记技术的PCR-RFLP方法(CAPS)被国外学者开发应用于油橄榄品种鉴定和适应性遗传多样性分析[10-11]。该方法通过简单的实验手段(克隆、测序和序列比对)检测碱基的序列差异，只需酶切具有突变的限制性内切酶位点序列即可直接通过琼脂糖凝胶电泳观测SNP 基因分型结果，方法简便易行。Ali[11]和Clarissa[10]等人分别利用CAPS技术对油橄榄品种做了遗传多样性分析和分类鉴别工作，而运用该技术对油橄榄进行适应性遗传多样性的研究国内尚未见报道。【本研究切入点】因此，本研究针对四川省3份具有不同气候特征的引种栽培地油橄榄品种皮瓜尔进行含油率测试分析比较，参考Ali[11]和Clarissa[10]等人报导的存在酶切位点的候选SNP位点序列，对这些序列进行克隆测序和序列比对，检测四川省不同引种栽培地皮瓜尔品种间的碱基序列差异，探讨同一品种引种到不同生态环境栽培地的适应性遗传多样性，以及将这些基因作为分子标记应用于不同引种栽培地皮瓜尔品种遗传差异检测的可能性。【拟解决的关键问题】本研究为今后油橄榄品种的栽培与利用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

在四川省收集3个具有典型气候特征的引种栽培地油橄榄品种皮瓜尔(原产于西班牙)作为供试材料。材料收集地、气候特征见表1。具体材料采集信息：西昌样品收集于凉山州西昌市西溪乡北河水库油橄榄生态示范园，达州样品收集于开江县红花山川东北油橄榄品种园，金堂样品收集于成都市金堂县淮口镇油橄榄产业示范园。供试地区气候特征通过搜集文献总结得出[12-15]。以嫩叶为提取基因组DNA的材料。采集嫩叶后放入装有硅胶的自封袋中，带回实验室置冰箱中-20 ℃保存备用。

1.2 菌株与试剂

大肠杆菌菌株Top10由本实验室保存，primerstar高保真酶，pMD19-T 载体购自TaKaRa 公司，植物基因组DNA 提取试剂盒(DP305-02)、琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP214-03)购自天根生化(北京)科技有限公司，PCR 引物合成和基因测序由北京擎科梓熙基因有限公司完成。其它化学药品为进口或国产分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 干果含油率的测定 采用索氏提取法测定干果含油率。方法：将鲜果烘干至恒重，打成细粉，用滤纸包裹好，每份5 g，记为M，一式三份；准备干净的圆底烧瓶(150 mL)，称重，记录圆底烧瓶的重量，记为M1(g)；将样品置于索氏抽提仪中，用正己烷回流提取 8 h，利用旋转蒸发仪将正己烷蒸干，记录含油圆底烧瓶的重量，记为M2(g)；按如下公式计算出干果含油率：含油率=(M2-M1)/M×100 %。

1.3.2 DNA的提取 每个栽培地油橄榄品种皮瓜尔取5个单株新鲜叶片组成混合样品池，采用天根公司植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并用1 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。

1.3.3 所选基因片段的克隆 采用Ali[11]和Clarissa[10]所提出的基因序列及引物，在此基础上筛选与油橄榄产量或含油率相关的6个基因作为研究对象(表2)。PCR反应体系和条件见文献[10-11]。所得产物经回收后克隆到pMD19-T载体上，转化E.coliTop10感受态细胞。菌落经PCR验证后，挑取阳性菌落送往北京擎科梓熙基因有限公司测序。利用NCBI Blast软件包对所得序列进行比对分析，确认序列的可靠性。

1.3.4 SNP位点检测分析 利用DNAMAN软件对已确认可靠的基因序列进行多重比对分析，从PCR扩增的DNA片断中找到单碱基突变位点，确定SNP。通过NEBCutter V2.0 软件(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)预测SNP位点所在的区域是否存在限制性酶切位点。随后对存在酶切位点的候选SNP位点进行PCR-RFLP 检测。应用相应的限制性内切酶对目标引物的PCR产物进行酶切反应。反应体系及条件见参考文献[10-11]。

表1 油橄榄干果含油率与栽培地气候特征

2 结果与分析

2.1 各引种栽培地皮瓜尔含油率评价

从表1可以看出，不同栽培区生态环境对油橄榄含油率影响不同，凉山州西昌地区拥有最充足的光热资源，气温、降水、空气湿度和日照等指标与其原产地西班牙地区接近，含油率最高，达州和金堂含油率低于西昌，属于四川省山地低海拔地区，多数因子符合油橄榄的生长条件，仅有少数因子欠佳，比如日照时数只有原产地的一半左右。有研究表明，油料植物对光与辐射能的需要量较其它植物更大，日照强度与时长会通过影响植物光合作用和果实发育的同化代谢过程，进而影响植物的产量、含油率和油脂成份[17]。因此日照时数的差异也许正是3个地区皮瓜尔含油率存在差异的原因之一。此外，周立江的分析指出，含油率和产量并不单受某一因子的影响，除了日照时数外，可能还受林地坡向、土壤、花与果实发育的气候条件影响[5]。由此可见，引种栽培区与原产区的环境异质性会导致植物的产量和品质存在差异。

2.2 相关基因片段SNP分析

通过对皮瓜尔3个栽培地所选基因的PCR扩增、克隆、测序，分别得到ANT基因279 bp、CBP基因333 bp、CHS基因300 bp、FAD2.1基因151 bp、LUP基因113 bp、ACP基因191 bp的编码区域DNA序列。运用NCBI、DNAMAN和NEBCutter V2.0软件对所克隆的序列进行SNP分析(表2～4)，结果显示：在相应长度核酸序列内ACP、FAD2.1和LUP基因在本研究3个栽培地不存在多态性；克隆长度为279 bp的ANT基因序列中有7个单核苷酸位点发生变异，导致了4个氨基酸位点产生突变，3个为同义突变，4个为有意义突变，多态性频率为1SNP/39.9 bp，其中达州ANT基因第181个位点的单核苷酸变异引起了1个限制性内切酶位点HphI的改变；达州、西昌的CBP基因序列显示出该基因片段含有一个EagI限制性内切酶位点，而金堂的该序列却因G-C的转换而失去这一酶切位点；类似的特点也存在于达州的CHS序列中，达州的CHS基因序列显示出该基因片段含有一个BsgI限制性内切酶位点，而金堂、西昌的该序列却因T-C的转换而失去这一酶切位点。

表2 SNP-CAPS标记引物信息

表3 基因片段单核苷酸变异位点

注：*代表CAPS位点。下同。

Note：*represents CAPS sites.The same as below.

表4 基因片段氨基酸变异位点

选择其中存在有合适内切酶的突变点，分别采用内切酶HphI、EagI 、BsgI及引物进行PCR产物的酶切检测。电泳检测及测序结果如图1。对3个区域3个基因CAPS 标记分析可以看出，依次采用ANT基因的SNP1-HphI标记可以将达州与金堂、西昌的皮瓜尔明显分开，CBP基因的SNP2-EagI标记将金堂与西昌的皮瓜尔区分开来；类似的首先采用CBP基因的SNP2-EagI标记可以将金堂与达州、西昌的皮瓜尔明显分开，随后采用CHS基因的SNP3-BsgI标记可将达州与西昌的皮瓜尔区分开来。因此，本研究得到2种SNP组合(SNP1-HphI/SNP2-EagI和SNP2-EagI/SNP3-BsgI)，可以完成对皮瓜尔品种区域多态性的鉴别，表明本研究中所用 SNP 位点具有良好的区域区分能力。

M:DNA Marker DL5000；1:达州；2：金堂；3：西昌图1 CAPS电泳(A)及测序结果(B)Fig.1 CAPS electrophoresis(A) and sequencing results of ANT, CBP and CHS(B)

3 讨 论

含油率是油橄榄育种考虑的首要性状，分析影响含油率高低的因素意义重大。本研究表明，西班牙油橄榄品种皮瓜尔引种到四川省达州、金堂、西昌3个地区栽培后，表现出不同的含油率，尤以西昌地区含油率最高，该地区生态环境因子与原产地极为相似，从日照时数指标看远远高于达州和金堂，说明日照时数是影响油橄榄含油率的一个关键生态因子，这与姚丽华[17]的报道是一致的。

影响油橄榄产量与含油率的因素较为复杂，尤其在长期的引种驯化过程中，一些性状难免会因环境或栽培条件的影响发生变异，导致其在遗传多样性上产生差异，而这些差异往往很难从形态学上进行鉴别，因此本研究基于特定的基因序列，利用CAPS技术对引种到四川省达州、金堂、西昌3个地区栽培地的皮瓜尔进行适应性遗传多样性研究，分析各栽培地皮瓜尔资源的多态性。与先前Ali对土耳其油橄榄的分析结果相比，本次供试材料的遗传多样性差异要相对低一些，说明3地的油橄榄品种皮瓜尔资源存在遗传相似性较高、遗传基础较窄的情况，尽管如此本研究运用SNP与限制性内切酶相结合的策略，仍选择出了3个SNP标记(2种SNP组合)得以对皮瓜尔品种的区域多态性加以鉴别。此外，本研究所选择的基因主要参与了油橄榄的逆境胁迫、果实发育等过程[18-19]，筛选获得的SNP处于基因的编码区，可能会在分子功能和生物过程方面发挥重要的作用，后期将对这些基因更多的SNP进一步检测，并且和含油量、产量等性状联系起来分析，找到影响这些指标的SNP，为油橄榄的分子育种提供SNP分子标记，以期在种质资源保护、品种鉴别、适应性遗传多样性研究以及生态演化等领域得到广泛的应用。

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(责任编辑 陈 虹)

Analysis of Oil Content and Genetic Diversity for Introduced Picual Cultivars in Sichuan Province

ZHAO Qi1, GUO Xiao-qiang1, ZHUANG Guo-qing1, YAN Jun1, HE Shi-qin3, LI Rui1*

(1.College of Pharmaceutical and Biological Engineering,Chengdu University,Sichuan Chengdu 610106,China;2.Sichuan Academy of Forestry,Sichuan Chengdu 610081,China;3.Sichuan Tianyuan Olive Co.,Ltd.,Sichuan Dazhou 636251,China)

【Objective】Olive(OleaeuropaeaL.) which can be used for oil and food is a kind of important economic forest tree. Oil content is an important factor affecting the economic value of olive. Factors that affected oil content include ecological environment and genetic potential.【Method】 In this paper, theOleaeuropaeaL.varieties ( Picual) from Dazhou,Jintang and Xichang in Sichuan province were used as tested materials, firstly, the climatic characteristics of Picual between the origin (Spain) and cultivation areas (Dazhou, Jintang and Xichang) were evaluated, combining with the oil content data detected, sunshine duration was the key factor which affected the oil content, the related gene segments in three introduced areas (Dazhou, Jintang and Xichang) by using PCR technology were cloned, and their sequences were made for SNP analysis. 【Result】SNPs in three gene fragments of anthocyanidin synthase, calcium binding protein and chalcone synthase were detected, a total of three CAPS sites were found, and 2 pairs of three CAPS sites (SNP1-HphI/SNP2-EagI and SNP2-EagI/SNP3-BsgI) could differentiate between the Dazhou, Jintang and Xichang of Picual with rapid and accurate identification.【Conclusion】In the next future, the further research on the functional difference of these genes would be carried out to lay the foundation for olive breeding.

OleaeuropaeaL.; Oil content; SNP; Genetic diversity

1001-4829(2017)6-1279-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.007

2016-07-10

四川省科技厅应用基础项目“四川油橄榄主产区产油地域性差异的分子基础研究”(2013JY0057)

赵 琦(1981-)，男，河北满城人，副教授，从事植物生物工程技术研究；*为通讯作者，E-mail：lirui1986523@163.com。

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