不同转种密度对体外培养阴道毛滴虫效果的影响

伏晨卉，张彦彦，苗玉倩，孙明丽，孔学敏，王丽娜

（1.承德医学院2011级基础医学院，河北承德　067000；2.指导教师）

学生园地

不同转种密度对体外培养阴道毛滴虫效果的影响

伏晨卉1，张彦彦1，苗玉倩1，孙明丽1，孔学敏1，王丽娜2

（1.承德医学院2011级基础医学院，河北承德067000；2.指导教师）

阴道毛滴虫；转种密度；体外培养；肝浸汤培养基

阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）是人体泌尿生殖系统感染的常见病原体，主要引起滴虫性阴道炎或尿道炎，若不及时治疗，易造成交叉感染和反复感染，严重影响患者的身心健康［1］。滴虫病是性传播疾病，有助于HIV的传播［2］。近年来，该病有上升的趋势，有资料显示，阴道毛滴虫可以传染给婴儿［3-5］。越来越多的医学工作者及科研人员致力于阴道毛滴虫的研究，体外培养阴道毛滴虫成为科研与教学中的一项重要基本工作。随着分子克隆技术的发展，阴道毛滴虫的科学研究达到新的领域，但其前提是需要分离培养出高质量的虫体。目前，体外培养阴道毛滴虫的研究报道颇多，但对其转种密度的研究国内未见报道［6-9］。因此，为了节约资源以及达到最好的观察和研究效果，找到适合阴道毛滴虫的最适转种密度和最佳生长时间尤为重要。

1　材料与方法

1.1实验虫种采自承德市妇幼保健医院妇科门诊滴虫性阴道炎患者的阴道分泌物。采用消毒棉拭子签在阴道后穹隆处取分泌物，接种于肝浸汤培养基中，37℃无菌培养，阴道毛滴虫每48h传代1次，培养3代后用于实验。

1.2方法

1.2.1肝浸汤培养基：将兔肝15g剪成小块，研碎后置于100ml蒸馏水中，然后放入4℃ 冰箱内冷浸过夜，次日加热煮沸半小时，用纱布过滤除去沉渣，再向滤液中加蒸馏水，以补还加热时蒸发失去的水量，即得澄清的15%肝浸汤。然后加入蛋白胨2g，半胱氨酸盐酸盐0.2g，麦芽糖1.0g，氯化钠0.5g，并加热使试剂溶解，调pH为5.6，过滤，分装每试管5ml，塞以非脱脂棉花，高压灭菌后置37℃恒温箱中24-48h，保存于4℃冰箱中备用。转种前，每管中加入无菌灭活小牛血清1ml，青霉素和链霉素浓度各达1500U/ml，放温箱中20min即可转种。

1.2.2虫种准备：取经3代培养的滴虫再培养48h，用吸管从培养管底部吸滴虫悬液3ml，80g离心10min，用血细胞记数器记数虫体后定量。将阴道毛滴虫以不同的转种密度转种至肝浸汤培养基，每管虫数分别为2.0×104个/ml、6.0×104个/ml、10.0×104个/ml、14.0×104个/ml、18.0×104个/ml。每24h显微镜下观察，并比较阴道毛滴虫的活跃度和数量。

1.2.3实验观察与结果判断：每隔24h（24h、48h、72h、96h、120h）振荡摇匀各管，吸取20μl培养物滴于载玻片上，加盖玻片，镜检，高倍镜下观察每个视野虫体的活跃度和存活虫数，即生长密度。虫体活跃度的判断标准：“++++”为10秒内虫体旋转6-10周，摇摆21-30次，鞭毛和波动膜运动活跃；“+++”为10秒内虫体旋转1-5周，摇摆11-20次，鞭毛和波动膜运动活跃；“++”为10秒内虫体停止旋转，摇摆1-10次，鞭毛摆动活跃，波动膜运动不活跃；“+”为虫体变圆，10秒内虫体静止不动或摇摆1-5次，鞭毛摆动不活跃，波动膜停止运动；“－”为虫体变圆，虫体静止不动，鞭毛和波动膜停止运动。为避免漏检，如未观察到活的虫体，则对阴性培养物再作正常转种培养，48h后取管底培养物镜检，仍未见活的虫体才可判断为“－”。

2　结果

不同转种密度阴道毛滴虫在肝浸汤培养基中的繁殖情况（附表）：24h时生长密度随着滴虫密度的增大而逐渐增大，虫体运动活泼；48h时，生长密度均较24h增大，随着滴虫密度的增大而逐渐增大，14.0×104个/ml与18.0×104个/ml的培养基中阴道毛滴虫到达生长高峰，生长密度差别不大，且虫体的活跃度有所下降；2.0×104个/ml、6.0×104个/ml与10.0×104个/ml培养基中的阴道毛滴虫均在72h时到达生长高峰，但10.0×104个/ml密度虫体活跃度有所下降。随着时间延长，不同密度培养基中的阴道毛滴虫生长密度均下降明显，虫体运动微弱，至120h时，除2.0×104个/ml的培养基中还可见活体外，其余培养基中的阴道毛滴虫全部死亡。

3　讨论

目前关于阴道毛滴虫培养研究的报道较多，其中肝浸汤培养基是最常用的培养基［6，10］。本研究是将从临床分离的阴道毛滴虫培养到最佳状态时，以不同的接种量转种至肝浸汤培养基，观察并比较阴道毛滴虫的增殖情况，探索阴道毛滴虫的最适转种密度和处于最佳生长状态的时间。

附表　肝浸汤培养基体外培养阴道毛滴虫的效果比较

本研究中，阴道毛滴虫刚转入新的培养基，由于条件适宜，营养物质丰富及pH值合适，所以生长状况较好，繁殖较快。随着虫体的数量增加，密度增大，营养物质消耗增多，培养基内营养物质逐渐缺乏，乳酸等代谢产物随之增加，使pH降低，环境的变化使阴道毛滴虫生长受到抑制，出现虫体大量死亡、裂解，最终培养基中无活体，镜检为阴性。不同密度的阴道毛滴虫在肝浸汤培养基中的生长趋势为先迅速繁殖，到达高峰后下降，活跃度也随之下降。阴道毛滴虫的转种密度越低，到达生长高峰的时间越长；转种密度越高到达生长高峰的时间越短，但10.0×104个/ml、14.0×104个/ml与18.0×104个/ml的培养基中阴道毛滴虫到达生长高峰时，虫体活跃度已经下降。

综合比较，肝浸汤培养基中阴道毛滴虫的转种密度为10.0×104个/ml时，生长繁殖速度非常快，48h时生长密度较大，活跃度最好，适合教学与科研，但是培养基营养成分消耗大，需48h就得转种，浪费物资和人力。肝浸汤培养基中阴道毛滴虫的转种密度为6.0×104个/ml时生长繁殖速度相对较缓，72h时生长状态最佳，所以可72h进行转种，既节约成本，又不浪费人力，适合长期保种。在实际工作中，可根据不同的需要选择适合的转种密度。

［1］崔晶，姜鹏，王中全.新时期病原生物学研究生培养模式改革探讨［J］.中国病原生物学杂志，2012，7（6）： 476-478.

［2］黄敏.医学微生物学与寄生虫学［M］.第3版.北京：人民卫生出版社，2013.272-274.

［3］Smith LM，Wang M，Zangwill K，et al.Trichomonas vaginalis infection in a premature newborn［J］.J Perinatol，2002，22（6）： 502-503.

［4］Hoffman DJ，Brown GD，Wirth FH，et al.Urinary tract infection with Trichomonas vaginalis in a premature newborn infant and the development of chronic lung disease［J］.J Perinatol，2003， 23（1）：59-61.

［5］Bruins MJ，van Straaten IL，Ruijs GJ.Respiratory disease and Trichomonas vaginalis in premature newborn twins［J］.Pediatr Infect Dis J，2013，32（9）：1029-1030.

［6］杨堵华，姚繁荣，答嵘.阴道毛滴虫在两种培养基中的生长与形态观察［J］.中国寄生虫病防治杂志，2004，14（1）209-210.

［7］徐露，王宇学，周玉娟.肝浸汤培养阴道毛滴虫的改进［J］实用医技杂志，2008，15（18）：2366-2367.

［8］刘晓泉，田春林，王卫群.阴道毛滴虫长期培养传代的实验观察［J］.应用预防医学杂志，2009，15（1）：16-18.

［9］陈熙，周本江.体外培养阴道毛滴虫的形态定量观察［J］昆明医科大学学报，2013，（5）：14-17.

［10］耿志辉，韩淑梅，刘利，等.3种不同培养基体外培养阴道毛滴虫效果的比较［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志2002，120（1）：42-44.

（学生园地栏目编辑：张健）

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1004-6879（2015）06-0536-02

2015-01-26