阔叶十大功劳总生物碱提取及小檗碱含量测定

周先强，田丹妹，余林健，许荣煌，唐金山，姚志红*

（暨南大学药学院，中药及天然药物研究所及中药药效物质基础及创新药物研究广东省高校重点实验室，广东 广州510632）

中药阔叶十大功劳为小檗科（Berberidaceae）十大功劳属阔叶十大功劳 [Mahonia bealei（Fort.）Carr.]的茎[1]，具有滋阴补阳、清热解毒的功效，主治肺热、咳嗽、肠炎、痢疾、疮疡和湿疹等症[2]。

阔叶十大功劳的主要活性物质为生物碱类化合物[3]，其中小檗碱为主含成分。 小檗碱的降血脂作用最初在实验性治疗非胰岛素依赖型糖尿病模型中被发现[4]，其后受到国内外研究学者关注。 研究表明[5-6]，给高脂模型的实验鼠每天灌胃150～162 mg/kg 的小檗碱，6 周后实验鼠的游离脂肪酸比模型组明显降低；前期本课题组通过广泛筛选的方法， 发现中药阔叶十大功劳具有明显的HMGCoA 还原酶抑制活性，提示其具有良好的降血脂活性，对其中生物碱类成分进一步研究发现，小檗碱和巴马汀均显示出HMG-CoA 还原酶抑制活性。

因此，本实验以总生物碱提取率为指标，采用紫外分光光度法测定总生物碱含量，结合正交设计法进行阔叶十大功劳中总生物碱提取工艺的筛选和优化， 并对其中主要活性成分小檗碱建立HPLC含量测定方法。

1 仪器与材料

Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪(G1379A在线脱气机、G1313A 四元梯度泵、G1311A 自动进样器、G1365B 紫外检测器，美国Agilent 公司)；JASCO V-550 紫外可见分光光度计（佳司科（上海）贸易有限公司）；Sartorius BP211D 电子天平(德国Sartorius 公司)；昆山KQ3200E 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

盐酸小檗碱对照品（上海睿升化工科技有限公司，批号：20131201，纯度98.9%）；阔叶十大功劳提取物由本课题组提供；甲醇（迪马科技公司）、甲酸(广州泛宏贸易有限公司)、乙腈（迪马科技公司）均为色谱纯；蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。阔叶十大功劳药材在广西武鸣县双桥乡采集，由广西中医药大学的韦松基教授鉴定为阔叶十大功劳（M. bealei）。

2 实验方法与结果

2.1 总生物碱含量测定方法的建立

2.1.1 对照品溶液制备方法 取盐酸小檗碱对照品，精密称定，置10 mL 容量瓶中，用含1‰甲酸的甲醇溶解并定容，摇匀，配制成0.1 mg/mL 溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液制备方法 取阔叶十大功劳提取物粉末，精密称定，置25 mL 容量瓶中，用含1‰甲酸的甲醇溶解并定容，摇匀，配制成0.4 mg/mL 溶液，备用。

2.1.3 标准曲线的制备 分别精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL， 置10 mL 容量瓶中，用含1‰甲酸的甲醇定容，摇匀，在345 nm 处测定其吸光度（A）值。 以A 值为纵坐标，质量浓度C（μg/mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程

结果表明盐酸小檗碱在2.2～13.2 μg/mL 线性关系良好。

2.1.4 精密度试验 盐酸小檗碱对照品溶液在高、低两个浓度下RSD 分别为0.42%和0.54%，表明仪器的精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 24 h 内对照品及样品溶液吸光度值RSD 分别为0.73%和1.08%，表明对照品及样品溶液在24 h 内稳定。

2.1.6 重复性试验 取同一批次阔叶十大功劳提取物，精密称定，按“2.1.2”项下平行制备6 份阔叶十大功劳提取物的供试品溶液，同“2.1.3”测定，计算其含量的RSD 为2.54%，表明方法重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验 精密吸取样品溶液（已知总生物碱含量）6 份，每份0.4 mL，分别按相当于样品溶液中总生物碱含量加入盐酸小檗碱对照品溶液，在345 nm 处测定其吸光度，计算回收率，结果平均回收率为100.0%，RSD 为1.14%， 表明该方法准确可靠。 见表1。

表1 总生物碱中盐酸小檗碱加样回收率试验

2.2 总生物碱提取工艺的优化

2.2.1 因素水平的设计 选择影响常规回流提取的四个因素，即乙醇浓度、提取次数、乙醇用量、提取时间，因素水平设计见表2。

表2 提取工艺因素水平表

2.2.2 正交试验方法设计[7]与结果 取200 g 阔叶十大功劳药材，在平行条件下按照L9(34)正交表安排进行加热回流提取试验，每个样品提取完毕，滤过，合并滤液，旋蒸至一定的体积，冷冻干燥，得阔叶十大功劳总浸膏得率， 以总生物碱提取率为考察指标进行工艺优选。 结果见表3。

以总生物碱为考察指标，由表3 中极差R 值大小显示， 各因素作用主次为A＞B＞D＞C （即乙醇浓度＞提取次数＞提取时间＞乙醇用量），表4 方差分析结果表明乙醇浓度对收率有高度显著影响，提取次数和提取时间对生物碱收率有显著影响，最佳工艺条件为A2B3C1D2（即6 倍量浓度为80%乙醇提取4次，每次2 h）。

表3 L9(34)正交试验设计与结果 (n=2)

表4 总生物碱提取率方差分析表

2.3 阔叶十大功劳提取物中小檗碱含量HPLC 测定方法的建立

2.3.1 色谱条件 色谱柱Phenomenex C18色谱柱（4.6 μm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-水（各含体积分数为0.1%的甲酸）； 梯度洗脱0 min～15 min，28%～30%，流速1 mL/min；柱温35 ℃；检测波长345 nm；进样量2 μL。

2.3.2 对照品溶液制备 取盐酸小檗碱对照品约2 mg，精密称定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇适量溶解，用甲醇定容，摇匀，即得。

2.3.3 供试品溶液制备方法 取阔叶十大功劳提取物约10 mg，精密称定，置5 mL 容量瓶中，加甲醇适量，摇匀，超声处理(功率150 W，频率40 kHz)30 min， 取出， 放冷至室温， 用甲醇定容， 摇匀，0.45 μm 微孔膜滤过，取续滤液即得。

2.3.4 线性和范围考察 取对照品盐酸小檗碱适量，按“2.3.2”项下制备对照品溶液。 精密吸取此对照品溶液0.2、0.7、1.2、1.7、2.2、2.7 mL， 置5 mL 容量瓶中，并用甲醇定容，按“2.3.1”色谱条件进样分析，记录色谱图，以峰面积A 为纵坐标，以盐酸小檗碱浓度C 为横坐标进行线性回归计算，得盐酸小檗碱线性回归方程为：

表明小檗碱在36.00～486.0 μg/mL 范围内线性关系良好。 色谱图见图1。

2.3.5 重复性试验 取同一批阔叶十大功劳提取物粉末，分别按“2.3.3”项下平行制备6 份阔叶十大功劳提取物的供试品溶液，按“2.3.1”色谱条件，依次进样6 针，记录色谱图。 结果显示小檗碱平均含量为98.07 mg/mL，RSD 为2.05%，表明方法重复性良好。

2.3.6 精密度试验 取同一份阔叶十大功劳提取物的供试品溶液，按“2.3.1”色谱条件，连续进样6针，记录色谱图结果显示盐酸小檗碱峰面积的RSD为1.87%，表明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性试验 取同一份阔叶十大功劳提取物的供试品溶液，按“2.3.1”色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12 h 进样，记录色谱图。 结果显示盐酸小檗碱峰面积的RSD 为2.32%，表明供试品溶液在12 h 内稳定。

2.3.8 加样回收率试验 取盐酸小檗碱对照品约10 mg，精密称定，置20 mL 容量瓶，按“2.3.2”项下制备对照品溶液。 取同一批阔叶十大功劳提取物粉末6 份约5 mg，精密称定，置5 mL 容量瓶，加甲醇适量，并分别加入1 mL 对照品溶液，超声处理(功率150 W，频率40 kHz) 30 min，取出，放冷至室温，用甲醇定容，摇匀，过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液按“2.3.1”项下色谱条件测定，计算回收率，见表5，加样回收率的RSD 值为0.53%，表明该方法的准确度良好。

表5 阔叶十大功劳中小檗碱的加样回收率实验 （n=6）

A 阔叶十大功劳提取物供试品；B 盐酸小檗碱对照品

2.3.9 提取物中小檗碱含量的HPLC 测定 取同一批阔叶十大功劳提取物粉末，分别按“2.3.3”项下制备阔叶十大功劳提取物的供试品溶液，按“2.3.1”色谱条件，依次进样。 按“2.3.4”项下的线性回归方程进行计算，结果阔叶十大功劳提取物中的小檗碱含量为（108.37±6.00）mg/g。

3 讨论

3.1 关于紫外分光光度法测定总生物碱含量的波长选择

在190～500 nm 波长范围内的扫描结果表明：对照品溶液和供试品溶液的光谱图基本一致，均在（345±2）nm 处有最大吸收峰， 故选择345 nm 作为测定波长。

3.2 关于样品的前处理方法考察

本实验采用超声的方法对样品进行前处理，分别考察了20%甲醇-水、60%甲醇-水和甲醇3 种不同比例的提取溶剂，结果以甲醇为提取溶剂时小檗碱峰面积远大于其他两种方式， 且分离度符合要求。 比较不同超声时间处理后的样品图谱，发现超声30 min 与超声60 min 的峰面积相差不大且分离度相同，均远大于超声10 min。 因此确定了样品的前处理方法为以甲醇超声提取30 min。

3.3 关于最佳提取工艺优选

采用L9(34)正交试验进行工艺优选[8]，以有效成分总生物碱为指标，采用紫外分光光度发法测定总生物碱的量，优选出最佳工艺，可为阔叶十大功劳中总生物碱的提取提供参考。

致谢：药农黄仕文帮助采集药材，广西中医药大学韦松基教授帮助开展阔叶十大功劳的鉴定， 余林健、许荣煌等帮助制备阔叶十大功劳提取物。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第二十九卷)[M].北京：科学出版社，2001.

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