双丹明目胶囊对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜VEGF和VEGFR蛋白表达的影响

秦裕辉，李文娟，张 熙，戴宗顺，陈晓柳，周亚莎，凌艳君，郑 兵

（1.湖南省中医药研究院，湖南 长沙410006；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)性微血管病变中最重要的表现，是糖尿病的严重并发症之一。 DR 发病率随DM 病程的发展而增高，5年内DR 的发生率为44.4%，7年后为56%[1]。 DR 的特点主要为视网膜微血管进行性损害，血管通透性增加，新生血管形成，导致视力丧失。 DR 的发生、发展与多种生长因子和细胞因子有关，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、 碱性成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子、C 反应蛋白等[2]，其中VEGF是贯穿糖尿病视网膜病变发生、发展过程中最重要的因子[3]。

糖尿病视网膜病变中医称为“消渴内障”，基于中医“滋肾活血”的原则，我们研制了双丹明目胶囊（原名：降糖明目胶囊），并在2009年对双丹明目胶囊进行多中心临床试验，取得了良好的疗效[4]。 前期研究发现双丹明目胶囊能降低链脲佐菌素糖尿病大鼠模型血清VEGF 水平，降低眼组织VEGF 基因表达水平[5]。 本实验以VEGF 及其受体为中心，探讨双丹明目胶囊治疗糖尿病视网膜病变的作用机制，现将实验方法和结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 8 周龄健康， 无眼部疾患SD 大鼠40只（北京维通利华实验动物有限公司提供，SPF 级，远交系），体质量（200±50）g。 动物使用许可证号：SYXK（湘）2009-0001，质量合格证编号：11400700027462。饲养于湖南中医药大学动物中心， 大鼠自由摄食饮水，实验前饲养1 周。

1.1.2 主要药品 双丹明目胶囊： 北京岐黄制药有限公司， 批号：Z20080062； 羟苯磺酸钙 （Calcium dobesilate)，商品名“昊畅”：宁夏康亚药业有限公司，250 mg/粒，批号：1131115；重组人血管内皮抑制素注射液，商品名“恩度”：烟台麦得津生物工程股份有限公司，15 mg/（3 mL·支），批号：201307018。

1.1.3 主要试剂 链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）， 十二烷基硫酸钠 （Sodium dodecyl sulfate，SDS）：Sigma 公司；Anti-VEGF、Anti-VEGFR1、Antibeta-actin：北京博奥森生物技术有限公司;HRP goat anti-mouse IgG、HRP goat anti-rabbit IgG： 北京康为世纪生物科技有限公司；RIPA 裂解液：北京普利莱基因技术有限公司； 蛋白酶抑制剂：Merck 集团；蛋白磷酸酶抑制剂： 瑞士Roche 制药公司； 一抗[VEGF 磷酸化单克隆抗体（ab1316）、VEGFR 磷酸化单克隆抗体 （Sc-9029）]：Santa cruz Biotechnology；二抗[辣根过氧化物酶（HRP）二抗（2B-2301）]：北京康为世纪生物科技有限公司。

1.1.4 主要仪器 ONETOUCH Select Simpie 强生血糖仪：强生（中国）医疗器材有限公司；TS-92 摇床： 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；TGL-18R 台式冷冻离心机： 德国Eppendorf 公司；164-5050 电泳仪、DYCZ-40A 转膜仪、DYCZ-24EN 电泳槽均为北京市六一仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 造模[6-7]将40 只大鼠采用随机数字表法随机抽取10 只作为正常组，其余30 只造模。 造模前大鼠禁食10 h，自由饮水。 用STZ 剂量50 mg/kg 一次性大鼠尾静脉注射的方法造模。 正常组大鼠尾静脉注射等体积生理盐水。72 h 后取尾静脉血，强生血糖测试仪测血糖， 尿糖试纸定性测尿糖， 空腹血糖浓度>16.7 mmol/L、尿糖在+++以上者，即为DM 大鼠。成模后观察1 周，稳定者为DM 模型造模成功。

1.2.2 分组及给药 将造模成功后的30 只大鼠随机分为模型对照组、双丹明目组、阳性对照组3 组，每组10 只。 正常组和模型对照组均用生理盐水灌胃，剂量10 mL/（kg·d），双丹明目组用双丹明目胶囊溶液灌胃[8]加蒸馏水玻璃体腔内注射，双丹明目胶囊成人每日服用量为31.8 g/人，动物给药剂量按比例换算，剂量为5.6 g/（kg·d），蒸馏水2 mL/眼；阳性对照组用羟苯磺酸钙溶液（昊畅）灌胃加重组人血管内皮抑制素（恩度）玻璃体腔内注射[2]，昊畅1.0 g/（kg·d），恩度2 mL/眼，造模后第10 天开始玻璃体腔内注射，1 次/10 d。 各组大鼠均自造模成功后连续灌胃8 周，不限饮食，每日更换垫料1 次，按时通风，保持环境安静。

1.3 标本采集及指标测定

1.3.1 大鼠视网膜血管内皮细胞总蛋白的采集 10%水合氯醛过量麻醉后断头法处死动物， 即刻去除球外结缔组织，用700 ml/L 乙醇浸泡1 min，PBS 液冲洗后沿角膜缘后4 nm 剪除眼前节， 去除玻璃体和晶状体， 钝性分离出完整视网膜组织，D-Hanks 液中展平视网膜，剪除肉眼可见的视网膜大血管分支及部分色素组织，将剩余视网膜组织充分剪碎，200目筛网过滤， 收集网上组织置入15 mL 离心管中，在室温下加入2%胰蛋白酶消化20 min，1 200 r/min 离心10 min， 弃胰蛋白酶再加入0.1%Ⅰ型胶原酶消化20 min，离心半径20 cm，1 200 r/min 离心10 min，得到视网膜血管内皮细胞，将该细胞沉淀重悬于含10%特级胎牛血清和5 ng/mL β-ECGF的内皮细胞培养液中， 种植于涂有5 mg/mL 纤维黏连蛋白的培养皿内培养至融合。 细胞融合后，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液清洗3 次，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解后，置于离心机中，以1 200 r/min，在4 ℃温度下离心30 min，收集各组大鼠视网膜内皮细胞总蛋白。

1.3.2 Western blot 检 测VEGF 和VEGFR 蛋 白的表达[6]取样本进行12.5% SDS 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，电泳结束后转膜。 转膜完毕后，将膜取出放入TBS-T 中洗3 次，每次3 min。 封闭：配制5%脱脂奶粉，将膜浸入后，置4 ℃过夜。 结合一抗： 用封闭液将一抗1∶400 稀释， 与膜一起孵育3 h，室温振荡。 洗膜：TBS.T 洗3 次，每次5 min。 结合二抗：1∶3 000 稀释，与膜共同孵育1.5 h。 洗膜，同上。 暗室中在膜上滴加ECL，经适当显色后，用保险膜将膜包好，将膜放入暗盒中，上置医用X 光胶片，暴光适当时间，经显影，定影，室温下晾干。 图像扫描，灰度分析。 以VEGF、VEGFR 与β-actin 的光密度比值表示VEGF、VEGFR 蛋白的表达。 实验重复3 次。 应用图像分析软件Image J 进行光密度[IOD]半定量蛋白质检测。

1.4 统计学分析

所有实验数据采用SPSS 16.0 系统软件处理。计量资料实验数据以“±s”表示，先进行正态性分布及方差齐性检验，若满足正态性和方差齐性，多组比较采用方差分析（LSD 法及Dunnett 法）。 不满足正态性和方差齐性时， 则用非参多重比较。 以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

正常组中有少量VEGF 及VEGFR 表达； 模型对照组VEGF 及VEGFR 的表达量明显升高， 与正常组相比差异有显著统计学意义（P＜0.01）；双丹明目组和阳性对照组VEGF 及VEGFR 的表达量降低，与模型对照组相比差异有显著统计学意义（P＜0.01）；双丹明目组和阳性对照组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表1 及图1。

表1 各组大鼠视网膜血管中相对VEGF 蛋白及VEGFR 蛋白表达的比较 （±s，n=10）

表1 各组大鼠视网膜血管中相对VEGF 蛋白及VEGFR 蛋白表达的比较 （±s，n=10）

注：与正常组相比较※※P＜0.01；与模型对照组比较▲▲P＜0.01。

组 别正常组模型对照组双丹明目组阳性对照组药物剂量（g/kg·d）— —5.6 1.0 VEGF IOD 值0.127±0.025 0.347±0.031※※0.250±0.026▲▲0.213±0.012▲▲VEGFR IOD 值0.090±0.000 0.450±0.026※※0.197±0.050▲▲0.220±0.017▲▲

图2 各组大鼠视网膜血管中VEGF 及VEGFR 蛋白电泳图

3 讨论

DR 的发病机制目前尚不清楚， 通常为综合因素所致。 现有的研究表明DR 是一个多基因多步骤的疾病，其病理改变涉及到了代谢酶、炎症、细胞周期、信号传导、胞外基质及离子通道等相关基因的变化[9]。VEGF 是DR 过程中重要的因子，如果VEGF过度表达会导致血-视网膜屏障结构损伤， 促进视网膜血管新生。

在中医理论上，DR 名为“消渴内障”，根据患眼视觉变化及视力下降情况，将其纳入不同的病症中，如“视瞻昏渺”、“云雾移睛”、“血灌瞳神”、“暴盲”等。对本病各方面的科学研究发现“血瘀”在其发病机制中具有重要作用，认为病因病机为肾虚是根、阴虚为本、血瘀为标，概言之“肾虚血瘀”为其主要病机。 因此，认为DR 的治疗应该以“滋肾活血”为基本法则。基于这一法则，项目组研制了双丹明目胶囊，该药由女贞子、旱莲草、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、牡丹皮、丹参、三七、菝葜、牛膝11 味药物组成，方中女贞子、旱莲草滋补肝肾为君药；山茱萸、山药补肾养肝、健脾固精，丹参、三七养血活血、化瘀通络共为臣药；牡丹皮、泽泻、茯苓、菝葜清肝泻火、除湿利水为佐药；牛膝活血逐瘀、 强筋壮骨且性善下行， 可防血气上逆，为使药。 诸药合用共奏益肾养肝、活血明目之功，主治肝肾阴虚、瘀血阻络所致的DR。

本实验结果显示：与正常组相比，模型对照组VEGF 和VEGFR 蛋白表达升高 （P＜0.01）， 表明VEGF 及其受体参与了DR 的发生发展， 可能有助于评价视网膜病变的程度； 与模型对照组比较，双丹明目组和阳性对照组大鼠视网膜血管中VEGF和VEGFR 蛋白表达均明显降低（P＜0.01），双丹明目组和阳性对照组之间无显著性差异 （P＞0.05），说明双丹明目胶囊可减轻STZ 性DM 大鼠视网膜血管病理改变， 其可能机制是通过下调视网膜内VEGF、VEGFR 蛋白磷酸化水平，干预VEGF-VEGFR 信号转导通路。 因此认为双丹明目胶囊可通过降低VEGF 及其受体水平，从而抑制视网膜新生血管的形成，延缓DR 病情的发展。

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