OGG1 对PM2.5 造成人肺上皮细胞DNA 损伤的修复作用

杨拉维 王亚红 杨 腾 陈 婷 何惠娟 刘 刚

杨拉维 王亚红 杨 腾 陈 婷 何惠娟 刘 刚:广东医学院附属医院 广东湛江 524001

近年来，肺癌的死亡率日益升高，调查发现肺癌已经取代肝癌成为国际上恶性肿瘤死亡的第一大原因［1］。研究表明，大气污染物是肺癌的主要危险因素［2］，其中大气颗粒物是我国城市空气中的主要污染物之一。直径小于或等于2.5 μm 的细颗粒物(PM2.5)在大气颗粒物中占相当大的比重，约为70%，是空气中对人体健康危害最大的一类，随着工业的发展和机动车的增加，大气中颗粒物污染越来越严重，如果长期吸入颗粒物污染的空气，必将严重危害人类健康［3－4］。

细胞自身代谢和外源性的刺激都产生活性氧(ROS)，ROS可损害各种细胞成分，包括蛋白质、脂质和核酸，大量的研究表明ROS 能引起DNA 氧化损伤［5－6］，DNA 氧化损伤和癌症的发生是密切相关的。

细胞内8－羟基鸟嘌呤(8 －oxoG)是氧化损伤的产物之一，具有高的致突变性，8 －oxoG 与许多肿瘤的发生发展密切相关。细胞内特异识别并切除8 －oxoG 的酶称为8 －羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶，简称OGG1［7－8］。OGG1 基因位于人染色体3P25 区域，属于管家基因［9］。OGG1 基因编码产物OGG1 蛋白是一个带有AP 裂解酶活性的双功能DNA 糖苷酶。研究结果表明OGG1 的活性与肿瘤的发生密切相关［10－11］。

本实验室前期研究了不同城市PM2.5 的成分和细胞炎症的关系［12］，发现不同成分的PM2. 5 能诱导DNA 损伤，研究了OGG1 和肺癌的关系［13］，发现OGG1 和肺癌有显著的相关性，因此，我们研究OGG1 对PM2.5 造成人肺上皮细胞DNA 损伤的保护作用，并探讨可能的保护机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

(QJS －120F 智能中流量多级颗粒采样器(锦州利诚)，QJS－100 中流量多级颗粒切割器(锦州利诚)，CO2培养箱(Thermo公司)，酶标仪(Thermo)，FACSCalibur 流式细胞仪(BD 公司)，共聚焦显微镜(Leica，Bensheim，Germany)，Beas － 2b 细胞，DMEM 高糖(Hyclone)，胎牛血清(杭州四季青)，脂质体2000 转染试剂盒(Jnvitrogen，USA)，MTT(Sigma)，DCFH(Sigma)，彗星实验检测试剂盒CometAssay®Kit (Trevigen，USA).

1.2 PM2.5 的采集和制备

采集PM2.5 使用QJS－120F 中流量多级颗粒采样器，配置QJS－100 中流量多级颗粒物切割器，采样地点广东医学院附属医院临床医学研究中心六楼，采样流量100 L/min，连续采集72 h。将载有PM2.5 颗粒样品的纤维滤膜放入超纯水中，超声振荡15 min 以洗脱颗粒物，然后将样品真空冷冻干燥24 h，称重，加入一定量PBS 配制成储备液，高压灭菌，4 ℃保存，临用前震荡混匀。

1.3 细胞转染及染毒

人肺上皮细胞(beas－2b)用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养液，于37 ℃、5% CO2条件下培养，细胞融合80% 时用0.25%胰蛋白酶消化传代或用于实验。将前期研究已构建的OGG1 过表达载体按照Lipofectamine 2000 说明书操作，转染进beas－2b，并通过Western blot 检测beas－2b 内OGG1 表达水平。将正常beas－2b 细胞和转染了OGG1 过表达载体细胞分别正常培养到细胞融合80% 时，分别加入终浓度为100 μg/ml 的PM2.5，染毒24 h。

1.4 细胞内活性氧水平

分别收集染毒后的细胞，0.25%胰酶消化离心收集细胞，用PBS 漂洗两次，加入终浓度为5 μmol/L 的DCFH －DA 染色液，37 ℃作用30 min，PBS 漂洗两次，流式细胞仪测定细胞内二氯荧光素的平均荧光强度，检测转染OGG1 对细胞内活性氧水平的影响。

1.5 细胞DNA 损伤的检测

分别收集染毒后的细胞，用冰冷PBS 重悬细胞到1 ×105/ml，按1∶10(体积比)将细胞(1×105/ml)和融化的低熔点琼脂糖LMA(37 ℃)混合，并取50 μl 加到玻片孔，将玻片放入4 ℃冰箱避光10 min 使LMA 凝固，将玻片浸泡在裂解液中，置于冰上或4 ℃裂解30 ～60 min。甩干玻片多余的裂解液，将玻片浸入新制的解旋液中避光解旋20 ～60 min。加950 ml 预冷的电泳液，将玻片放入玻片孔处，21 V，电泳30 min。将玻片取出置于水中5 min，两次，然后置于70%酒精中5 min，低于45 ℃下干燥10 ～15 min，加入100 μl 稀释好的SYBR Green 到凝胶孔里，置于冰箱5 min，在室温避光干燥玻片，最后用荧光显微镜或者共聚焦显微镜观察。

1.6 统计分析

采用SPSS15.0 软件进行分析，所有实验均重复至少3 次。结果表示为(±SD)。

2 结果

2.1 OGG1 抑制PM2.5 诱导的细胞内活性氧水平升高

免疫印迹的实验结果表明OGG1 过表达载体成功转染进了beas－2b 细胞，并且编码OGG1 蛋白的产生，使转染组细胞的OGG1 蛋白水平明显高于未转染组。流式细胞仪的检测结果表明PM2.5 能诱导细胞内ROS 的水平升高，并且OGG1 能够显著的抑制PM2.5 导致的细胞ROS 升高(p＜0.01)(见图1)。这种对ROS 的抑制能力可能和OGG1 对8－oxoG 切除能力相关。

2.2 OGG1 抑制PM2.5 诱导的DNA 损伤

单细胞凝胶电泳的实验结果表明PM2.5 能够导致beas－2b细胞DNA 的损伤，损伤可能是由于PM2.5 诱导产生的细胞内高浓度的ROS 所导致的，对比对照组，OGG1 过表达能够显著的抑制PM2.5 导致的DNA 损伤(p＜0.01)(见图2)。OGG1 对DNA损伤的保护可能是同其抑制细胞内ROS 作用相关。

图1 免疫印迹检测OGG1 的过表达及OGG1 对beas－2b 细胞ROS 的影响

图2 彗星实验检测OGG1 对PM2.5 造成beas－2b 细胞DNA 损伤的修复作用

3 讨论

近些年来，随着工业的发展和机动车的增加，空气污染越来越严重。作为空气质量最重要的指标，PM2.5 指数已经在全国各大城市实行了实时监测。国内最近统计研究表明，恶性肿瘤中肺癌的死亡病例数排第一位［14］，越来越多的研究表明，PM2.5与哮喘、肺癌等一系列的肺部疾病的产生存在相关性。本实验研究表明，PM2.5 能够诱导细胞内活性氧的产生，能够导致细胞DNA 的损伤，这与之前的研究报道一致［15－16］。不同来源的PM2.5 的成分已经被研究得非常清楚，主要是多环芳烃(PAHs)和过渡金属元素［17］，随着对PM2.5 研究的深入，如何保护机体、减少PM2.5 对机体造成的损伤显得非常重要。

OGG1 是非常重要的碱基切除修复酶之一，在清除8 － oxoG，保护细胞功能方面发挥重要的作用。研究表明细胞核中的OGG1 的表达和蛋白活性都高于线粒体，线粒体中的氧化损伤和突变积累比细胞核更快。

致癌物苯并芘Bap 是多环芳烃的重要成分之一，有研究表明Bap 能够降低OGG1 的活性，诱导肺癌的产生［18］，也有研究表重金属导致的基因突变与OGG1 的活性降低有关［19］，因此PM2.5的致癌很可能与PM2.5 降低OGG1 的活性相关。

本研究表明，OGG1 的过表达对PM2.5 造成的DNA 损伤有明显的修复和减轻作用，但对于该修复和保护作用的具体分子机制还没有研究清楚，可能是和清除细胞内的ROS、保护线粒体的功能相关，PM2.5 是如何对线粒体造成的损伤以及OGG1 保护线粒体功能的分子机制需要后续试验进行验证。而基于OGG1 对PM2.5 造成的DNA 损伤有明显的修复和减轻作用，OGG1 可能成为PM2.5 导致的肺部疾病的一个治疗靶点。

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