Th17细胞相关因子在子痫前期和正常妊娠孕妇外周血和胎盘中表达量的对比

朱华英，朱丽，徐玲娣，陈廷美，刘颂平

·论著·

Th17细胞相关因子在子痫前期和正常妊娠孕妇外周血和胎盘中表达量的对比

朱华英，朱丽，徐玲娣，陈廷美，刘颂平

目的 通过对子痫前期及正常妊娠的孕妇外周血及胎盘组织中 Th17 细胞相关因子 IL-17、IL-21、IL-22、HLA-G 及RORc 表达量的检测以及 miRNA-21 相对表达量的比较，探讨 Th17 细胞相关因子以及 miRNA-21 在子痫前期发病中的作用。

方法 选取 2012年3月至 2014年5月镇江妇幼保健院的 40 例孕妇为研究对象，其中子痫前期孕妇 20 例，正常孕妇 20 例，采用流式细胞仪分别检测子痫前期组和正常对照组外周血中 Th17 细胞的水平，采用实时定量 PCR 法检测外周血和胎盘组织中 Th17 细胞相关细胞因子 IL-17、IL-21、IL-22、HLA-G、RORc 的表达量和相对表达量，采用实时定量 PCR 法检测胎盘组织中 miRNA-21 的相对表达量。

结果 初步证实子痫前期患者和正常妊娠女性外周血Th17 细胞相关细胞因子 IL-17、IL-21、IL-22、HLA-G、RORc 水平之间存在差异，子痫前期患者和正常妊娠女性胎盘组织中 Th17 细胞相关细胞因子 IL-17、IL-21、IL-22、RORc、HLA-G 水平存在差异。⑴子痫前期患者的 IL-17、IL-21、IL-22的相对表达量明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。⑵子痫前期组的 HLA-G、RORc 的相对表达量明显低于正常对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。⑶子痫前期组的 miRNA-21 的相对表达量明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。⑷各项指标之间及各检测指标与临床指标间存在相关性。

结论 Th17 细胞相关细胞因子 IL-17、IL-21、IL-22、HLA-G、RORc 水平在子痫前期的发病过程中可能发挥重要作用，通过对相关指标的监测可能预测子痫前期的发生和监测病情变化，阻断这一途径就有可能有效预防和治疗子痫前期。

子痫前期；Th17 细胞；实时聚合酶链反应

怀孕前血压正常的孕妇在妊娠 20 周以后出现高血压、蛋白尿的一类免疫系统疾病称为子痫前期［1］。子痫前期可伴有全身多脏器的损害，严重者出现胎盘早剥，弥漫性血管内凝血，甚至死亡，母婴健康受到严重影响［2］。在全球范围内，有 5%～14% 的孕妇患有子痫前期。在发展中国家中，子痫前期的发病率也高达 4%～18%［3］。子痫前期也成为孕产妇和围生儿发病及死亡的主要原因之一［4］。有报道称 Th17 细胞在免疫调控方面具有重要的研究基础和临床应用价值［5-6］。同时 miRNA 家族可能在促进子痫前期的发病方面“功不可没”［7-8］。但目前子痫前期的发病机制尚未阐明。所以本文针对 Th17 细胞分泌的 IL-17、IL-21、IL-22、RORc 以及 HLA-G 进行 PCR 定量检测，同时对 miRNA-21也进行了检测，希望从这些结果对比中找到子痫前期发病的原因，为未来子痫前期的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象和材料

选取 2012年3月至 2014年5月镇江妇幼保健院的 40 例孕妇为研究对象，其中子痫前期组孕妇 20 例（年龄：28.5 ± 2.2 岁），正常对照组孕妇 20 例（年龄：27.85 ± 3.0 岁）。两组孕产妇孕前均无高血压、心脏病、肾病、糖尿病、血小板减少等病史。子痫前期确诊标准参照《妇产科学》［9］：BP ≥ 160/110 mmHg（1 mmHg = 0.133 kPa）；尿蛋白 ≥ 2.0 g/24 h 或定性试验 ≥（++）；血清肌酐 ＞106μmol/L，除非以前就已有升高；血小板 ＜ 100 × 109/L；毛细血管病性溶血（LDH 升高）；ALT 或AST 升高；持续性头痛或其他大脑或视觉障碍；持续性上腹痛。详细记录孕产史、自觉症状、血压、尿蛋白、胎盘重量、新生儿体重、Apgar 评分等情况。两组孕妇均签知情同意书。

表1 一般临床资料比较Table 1 Comparison of general clinical data

试剂盒（FP401）购自日本 Toyobo 公司；Denley dragon Wellscan MK 3 酶标仪为芬兰Thermo 公司产品；TGL-168 型离心机为上海安亭科学仪器厂产品。

1.2 方法

1.2.1 标本采集

⑴血标本采集：产前采两组产妇的外周肘静脉血，取 0.5 ml 注入肝素无菌管中，8 h 内送流式细胞仪检验 Th17 细胞百分比。产前采两组产妇外周肘静脉血置于无菌 EP 管中，保存于 -80 ℃ 冰箱待 PCR 成批检测。

⑵胎盘采集：胎盘娩出后避开钙化灶，于胎盘正中母体面取下胎盘组织 l cm × l cm × l cm，经无菌生理盐水反复漂洗后置于无菌 EP 管中，保存于-80 ℃ 冰箱待 PCR 成批检测。

1.2.2 流式细胞仪检测两组产妇外周血中以IL-17+为特征的 Th17 细胞所占百分比 将两组孕妇的外周血抽取 0.5 ml 注入肝素无菌管中，标记 CD8-FITC 单克隆抗体和 CD3-APC 单克隆抗体，浓度稀释 1∶200，室温孵育 15 min。PBS 洗涤 2 次。通过流式细胞仪检测出以 IL17+为特征的 Th17 细胞在外周血中所占百分比。

1.2.3 PCR 技术检测两组绒毛和蜕膜中目的基因IL-17、IL-21、RORc 及 HLA-G 表达量 Tiangen Biotech 提取细胞总 RNA，按说明书操作。逆转录合成 cDNA，于 -20 ℃ 保存。采用 ABI 7500 PCR系统及 SYBRgreen I 染料法进行荧光定量 PCR 检测，采用 β-actin 作为内参照。所用引物由试剂公司设计合成，PCR 条件为 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，61 ℃ 1 min，共 35 个循环。

1.2.4 PCR 技术检测两组胎盘组织 miRNA-21的相对表达量 Tiangen Biotech 提取胎盘组织总RNA，按说明书操作。逆转录合成 cDNA，于 -20 ℃保存。采用 U6 RNA 作为内参照。所用引物由试剂公司设计合成。荧光定量 PCR 条件设置如下：95 ℃ 预变性 15 min，95 ℃ 变性 15 s，60 ℃ 退火 60 s，进行 35 个循环。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 临床一般资料比较

子痫前期组和正常对照组孕妇的年龄差异无统计学意义（P ＞ 0.05），但两组孕妇的孕周及新生儿体重差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。一般临床资料比较见表1。

2.2 外周血中 Th17 细胞代表因子 IL-17+水平比较

子痫前期组外周血中 IL-17+表达水平高于正常对照组，差异有统计学意义（P ＜ 0.01），且孕周不影响 IL-17+表达（P ＜ 0.05）（图1）。

图1 正常对照组和子痫前期组外周血中 Th17 细胞代表因子 IL-17+流式结果对比图（*P ＜ 0.05）Figure 1 Comparison of IL-17+flow cytometry results between the control group and the pre-eclampsia group （*P ＜0.05）

2.3 胎盘及外周血中 IL-17、IL-21 表达量的比较

子痫前期组胎盘和外周血中 IL-17、IL-21 的表达量明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.01）（图2）。

图3 正常对照组和子痫前期组胎盘组织中 RORc（A）和 HLA-G（B）表达量对比检测（**P ＜ 0.01）Figure 3 Comparison of the RORc（A） and HLA-G（B） expression levels in the control group and the pre-eclampsia group （**P ＜0.01）

2.4 胎盘中 RORc 和 HLA-G 的表达量的比较

胎盘中，子痫前期组的 RORc 和 HLA-G 的表达量明显低于正常对照组，差异有统计学意义（P ＜ 0.01）（图3）。

2.5 外周血中 Th17 细胞相关因子相对表达水平比较

子痫前期组外周血中 IL-17、IL-21、IL-22的相对表达量明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P ＜ 0.001）（图4）。

2.6 胎盘组织中 Th17 细胞相关因子相对表达水平比较

子痫前期组胎盘中 IL-17 和 IL-21 的表达量明显高于正常对照组，而 RORc 和HLA-G 表达量则低于正常对照组，差异均有统计学意义（P ＜ 0.01）（图5）。

2.7 胎盘组织中 miRNA-21 相对表达水平比较

图4 正常对照组和子痫前期组外周血 Th17 相关因子IL-17、IL-21 及 IL-22 相对表达量对比图（***P ＜ 0.001）Figure 4 Comparison of the expression levels of Th17-associated cytokines IL-17， IL-21 and IL-22 in peripheral blood （***P ＜ 0.001）

子痫前期组胎盘中 miRNA-21 相对表达量明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P ＜ 0.01）（图6）。

3 讨论

Th17 细胞是一种新型的 CD4+效应细胞，在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义。在自身免疫性疾病的研究中发现，Th17 细胞在类风湿性关节炎、多发性硬化、炎症性肠病等自身免疫性疾病中发挥着至关重要的作用［10］。妊娠其实就是母体对胎儿的免疫耐受调节的炎症反应过程，因此我们大胆推测 Th17 细胞在子痫前期的发病过程中可能发挥着一定作用。本文研究结果显示Th17 细胞分泌的 IL-17、IL-21、IL-22、RORc 以及 HLA-G 相关因子在子痫前期组和正常对照组之间存在明显的差异。IL-17、IL-21、IL-22 在子痫前期组中表达量明显高于正常对照组，可以看出子痫前期组 IL-17、IL-21、IL-22 释放量增加。而RORc 和 HLA-G 在子痫前期组中表达量明显低于正常对照组，可以看出子痫前期组 RORc 和HLA-G 释放被抑制。通过研究结果可以提示子痫前期的发病与 Th17 细胞释放的相关炎性因子有着很大的关系。

miRNA 家族是一类非编码 RNA，长约 22 个核苷酸，通过与靶基因 mRNA 的 3' 端非翻译去相互作用，从而调控靶基因的表达，进而广泛作用于生长发育、肿瘤发生、衰老凋亡、免疫应答等各种生物学过程［7］。本文研究结果显示，miRNA-21 在子痫前期组和正常对照组之间存在差异，miRNA-21在子痫前期组中释放量增加，说明 miRNA-21 与子痫前期的发病呈正相关，通过研究结果提示miRNA-21 参与子痫前期的发生发展过程。

图6 正常对照组和子痫前期组胎盘组织中 miRNA-21 相对表达量对比图（**P ＜ 0.01）Figure 6 Comparison of the miRNA-21 expression level in placenta tissues in the control group and pre-eclampsia group（**P ＜ 0.01）

本研究通过比较正常对照组和子痫前期组各类炎症因子指标数值，我们发现在子痫前期患者体内 IL17、IL21 的表达增加，ROR、HLA-G 的表达降低，miRNA-21 的表达增加。这一结果对于临床检测具有指导性意义。说明子痫前期组的免疫反应比正常对照组要明显，并且可能由于 HLA-G 的降低，子痫前期组更容易早产。ROR 表达的降低以及 miRNA-21 表达的升高说明了子痫前期患者体内细胞致瘤性比正常对照组大大增加。通过对相关指标的监测可预测子痫前期的发生和监测病情变化，阻断这一途径从而达到有效预防和治疗子痫前期的目的。早期诊断和早期干预将极大提高该病患者的生活质量，节约医疗资源，其社会经济效应意义重大深远。

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Methods This case-control study was conducted on 40 pregnant women. This comprised 20 women with pre-eclampsia and 20 healthy， age-matched pregnant women （controls）. Expression of IL-17， IL-21， RORc， HLA-G and miRNA-21 in placenta and peripheral blood were measured by flow cytometry （FCM）， ELISA and polymerase chain reaction （PCR）.

Results It was confirmed that patients with pre-eclampsia and normal pregnancy women showed different expressions of IL-17，IL-21， RORc and HLA-G associated with Th17 cells in peripheral blood and placenta as follows. （1） Expressions of IL-17 and IL-21 in patients with pre-eclampsia were higher than those in healthy women. The difference was statistically significant （P ＜ 0.05）. （2）Expressions of RORc and HLA-G in patients with pre-eclampsia were lower than those in healthy women. The difference was statistically significant （P ＜ 0.05）. （3） Expression of miRNA-21 in patients with pre-eclampsia was higher than that in healthy women. The difference was statistically significant （P ＜ 0.05）. （4） These data have correlation with clinical indicators. The difference was statistically significant （P ＜ 0.05）.

Conclusion Expressions of IL-17， IL-21， RORc and HLA-G associated with Th17 cells play an important role in pre-eclampsia. Through monitoring relevant indicators， the occurrence of pre-eclampsia might be predicted and monitored for the change of condition. Through early diagnosis and intervention along with safe and effective treatment， the quality of patient lives with pre-eclampsia could be greatly improved， thus saving more medical resources.

Comparison of expression levels of Th17-associated factors in placenta and peripheral blood between women with pre-eclampsia and healthy women

ZHU Hua-ying， ZHU Li， XU Ling-di， CHEN Ting-mei， LIU Song-ping

Objective To study the relationship between Th17 cells and relative factors with pregnancy-induced hypertension disease， we compared the expression of relative factors of Th17 cells in placenta and peripheral blood from women with pre-eclampsia and healthy women.

Pre-eclampsia；Th17 cells；Real-time polymerase chain reaction

XU Ling-di， Email： 25813211928@qq.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.06.012

江苏省卫生厅重大项目（H201249）

212000 镇江市，江苏大学附属第四人民医院（镇江市妇幼保健院）妇产科（朱华英、徐玲娣、陈廷美、刘颂平）；212013 镇江市，江苏大学医学院（朱丽）

徐玲娣，Email：25813211928@qq.com

2015-08-19

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2015, 10(6):528-532

Author Affiliations： The 4th People′s Hospital Affiliated to Jiangsu University， Jiangsu University Medical College， Zhenjiang 212000， China （ZHU Hua-ying， XU Ling-di， CHEN Ting-mei， LIU Song-ping）； School of Medicine， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China （ZHU Li）

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2015, 10(6):528-532