黄芩悬浮细胞培养过程中黄芩苷与蛋白质含量相关性分析

张东向 焦战战 张令昂 邱全权 赵静 刘丽洁

摘要：以黄芩悬浮细胞为材料研究其生长过程中蛋白质含量变化规律及与黄芩苷次生合成之间的关系。结果表明，在黄芩悬浮细胞生长周期（21 d）内，蛋白质含量的高低与黄芩苷的积累呈正相关。在黄芩悬浮细胞生长周期的前6 d，悬浮细胞处于潜伏期，蛋白质含量低水平表达，黄芩苷合成缓慢； 6～18 d，悬浮细胞处于生长期，蛋白质的含量高水平表达，合成速率较快，这期间黄芩苷也迅速合成； 18～21 d，悬浮细胞进入稳定期，此时蛋白质含量处于稳定期，黄芩苷合成也几乎停止。同时采用L9（34）正交试验研究培养基中6-BA、碳源、氮源、pH的配比对蛋白质含量表达的影响，结果表明碳磷源（NH4+）对蛋白质的表达影响最大。

关键词：黄芩；悬浮细胞；黄芩苷；蛋白质含量；正交试验

中图分类号：R282.71 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）21-5338-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.033

Analyses of the Correlation between Baicalin and Protein Content in the

Scutellaria Suspension Cells

ZHANG Dong-xiang， JIAO Zhan-zhan， ZHANG Ling-ang，Qiu Quan-quan ZHAO Jing， LIU Li-jie

（College of Life Science and Forestry， Qiqihar University， Qiqihar 161006， Heilongjiang， China）

Abstract： Taking the scutellaria suspensioncells as the material， the relationship between the protein content and baicalin secondary synthesis in the growth process of the scutellaria suspension cells was investigated. The results showed that during the growth cycle （21 days） of the scutellaria suspension cells， the content of protein and the accumulation of baicalin was positively correlated. During the former 6 days of the growth cycle of the scutellaria suspension cells， the skullcap cells was in incubation period， the content of the protein express at a low level and the synthesis of baicalin was slow. During 6 to 18 days， the cells was in its growing phase， the content of protein expressed at high levels， at the same time baicalin rapidly synthetised. During 18 to 21 days， the cells was in its stable period， the content of baicalin was also in its stable period， the synthesis of baicalin almost stopped， meantime， L9（34） orthogonal table was used to optimize the ratio of medium 6-BA， carbon sources， nitrogen sources and pH， it was conducted that carbon sources had the maxium influence on the protein expression.

Key words： Scutellaria Baicalensis Georgi； scutellaria suspension cells； Baicalin； protein content； orthogonal experiment

中药黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效[1]。其主要成分黄芩苷（Baicalin），具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗血栓形成和保护肝脏、心脑血管、神经元等作用[2]。大多数酶都是蛋白质，而酶的活性又与次生代谢有关联，比如黄芩体内过氧化物酶能够催化黄芩有效成分黄芩苷与过氧化氢反应生成黄芩素[3，4]。孙守慧等[5]研究杨树次生代谢物质与青杨天牛酶活性的关系，任振兴等[6]研究表明黄芩愈伤组织中多酚氧化酶活性与黄芩苷合成有相关性。为此，研究了黄芩悬浮细胞中黄芩苷与蛋白质含量的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

黄芩悬浮细胞（实验室筛选，来源于黄芩悬浮细胞的诱导[7]）。继代培养基：液体SM培养基（附加1.0 mg/L的6-BA和0.2 mg/L的2，4-D），蔗糖3%，pH 5.8，暗培养，温度（25±1） ℃，培养周期21 d。

YPL-1全温摇瓶柜，T6新世纪型紫外可见分光光度计，GTR16-2型高速台式冷冻离心机。

1.2 方法

1.2.1 黄芩悬浮细胞鲜重测定 采用电子天平称量，在超净台测培养瓶中悬浮细胞鲜重，称完后继续培养，并做好记录。液体培养基的基本成分同MS固体培养基，只是去除琼脂，根据试验目的不同向培养基中添加不同的待研究成分。液体悬浮培养培养基装液量为70 mL/250 mL三角瓶， 接种量 3 g/70 mL培养基。培养温度（25±1） ℃，摇床转速110～130 r/min。

1.2.2 黄芩悬浮细胞干重测定 在超净台中，每隔3 d取悬浮培养物，抽滤使培养物与培养液分离，收集培养液测定其相关成分的含量。细胞于60 ℃烘至恒重，用电子天平称细胞干重（预先称好滤纸的质量），根据取样体积与总培养液比例计算培养基中细胞干物质的浓度与干重。

1.2.3 黄芩苷含量测定 采用紫外分光光度法测定[8]，在超净台中，每隔3 d取2 mL悬浮细胞，通过抽滤分离培养液与培养细胞。培养液中的黄芩苷含量：将培养液置于60 ℃烘箱中烘干，然后加入10 mL 50%乙醇温浴提取、定容，可见分光光度计在278 nm处测光密度（OD）值，依据标准曲线方程（图1）计算黄芩苷浓度C。培养细胞中的黄芩苷含量：将细胞培养物60 ℃烘至恒重，研成粉末，过50目筛。称取适量干燥的细胞培养物，加入10 mL 50%乙醇，50 ℃温浴5～6 h。冷却后用50%乙醇定容。用去离子水稀释适当倍数，摇匀，作为待检样。可见分光光度计测定278 nm处OD值。依据标准曲线方程（图1）计算黄芩苷浓度C。培养悬浮细胞中总黄芩苷含量=培养液中黄芩苷含量+细胞中的黄芩苷含量。

1.2.4 蛋白质的提取（TCA—丙酮沉淀法[9-10]） 称取新鲜的材料0.5 g，在液氮中研磨悬浮细胞，加入样品体积3倍的提取液[含10%TCA和0.07%的 β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7 g尿素、0.2 g CHAPS溶于3 mL灭菌的去离子水中（终体积为5mL）]，使用前再加入1 mol/L的DTT 65 μL/mL。在-20 ℃过夜，然后4 ℃ 8 000 r/min离心1 h，弃上清。加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后4 ℃ 8 000 r/min离心1 h，然后真空干燥沉淀，备用。上样前加入裂解液，室温放置30 min，使蛋白充分溶于裂解液中， 15 ℃ 8 000 r/min离心1 h，或更长时间，以没有沉淀为标准，4 ℃保存备用。

蛋白质标准曲线绘制：在紫外-可见分光光度计595 nm处测定吸光值[11]。用不同浓度的牛血清蛋白标作为标准液，每只试管加入5.0 mL考马斯亮蓝，摇匀，放置5 min，以A595 nm吸光值为纵坐标，牛血清蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线（图2）。

1.2.5 蛋白质含量测定 将提取的蛋白质溶液稀释到一定的浓度，加入5.0 mL考马斯亮蓝，摇匀，放置5 min，加入比色皿中，在紫外-可见分光光度计595 nm处测定吸光值。用测得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清清蛋白的μg数，计算出待测蛋白质的含量[11]。

1.2.6 正交试验 对培养基中6-BA、碳源、氮源、pH的配比对蛋白质表达的影响进行了L9（34）正交试验（表1）。

2 结果与分析

2.1 黄芩悬浮细胞的生长曲线和黄芩苷合成曲线

将新鲜的黄芩愈伤组织研磨成细胞状，接种于液体培养基中，每瓶接种量约2.0 g，置于摇床中暗培养，从第3天起每隔3 d取样一次，测定黄芩悬浮细胞的生长量（鲜重与干重）和黄芩苷的量。

图3、图4显示，黄芩悬浮细胞的生长曲线呈典型的“S”形，0～6 d为潜伏期，6～18 d为快速合成期，18～21 d为稳定期，黄芩悬浮细胞生长变缓。从图5可以看出，黄芩苷在前6 d合成比较缓慢，6～18 d为黄芩苷的快速合成期，之后黄芩苷的量变化不大。

由图3、图4和图5可知，黄芩悬浮细胞的生长和黄芩苷合成积累基本上同步，边生长边合成。在悬浮细胞生长的前6 d，悬浮细胞内主要是适应从固体培养到液体培养的环境，这一时期细胞的生长量和黄芩苷的合成量都不明显；但随着细胞适应液体培养的环境后，细胞的生长量和黄芩苷的合成都迅速增加；到了后期，由于液体培养基成分的逐渐消耗，这一时期细胞的生长量和黄芩苷的合成量开始变得不明显，达到一种稳定的状态。

2.2 黄芩悬浮细胞中蛋白质含量的变化规律

将新鲜的黄芩愈伤组织研磨成细胞状，接种于液体MS培养基上，每瓶接种量约2.0 g，置于摇瓶柜中暗培养，从第3天起每隔3 d取样一次，按上述方法测定蛋白质含量。

图6显示，在黄芩悬浮细胞生长周期的前6 d，蛋白质含量低水平表达，含量为0.154 3 mg/g；6～18 d，蛋白质含量高水平表达，蛋白质含量不断积累，最大值达2.345 9 mg/g；18 d后蛋白质含量达到稳定状态。

由图7可以看出，蛋白质含量高低与黄芩苷的积累呈正相关，回归方程为y=27.474 x+10.167，回归系数R2=0.989，然后对回归方程进行方差分析（表2），显著性检测结果P=4.34×10-6<0.05，表明方程回归显著。

通过正交设计L9（34）优化培养条件，测定不同条件下蛋白质的含量，对结果进行分析（表3）。从表3可以看出，因素A、B、C、D变化对蛋白质含量影响最明显的为碳源。图8显示，在不同培养条件下，蛋白质含量的变化趋势基本相同，主要合成在6～18 d期间。

3 小结与讨论

植物体中的反应绝大多数是酶促反应，而酶绝大多数是蛋白质。很多研究表明，植物次生代谢产物与酶活性有关联。本试验研究结果表明，在黄芩悬浮细胞中蛋白质的含量与次生代谢产物黄芩苷的含量相关。在黄芩悬浮细胞生长周期前6 d，细胞处于缓解期，主要原因是，由固体培养到液体培养需要一个缓冲的过程，因此在这一时期初生代谢和次生代谢都很缓慢；而6 d后初生代谢和次生代谢产物迅速合成，这一点不同于组织培养；到18 d后达到稳定期，原因在于培养液的减少抑制了产物的合成。

本试验结果表明，蛋白质含量的变化规律与黄芩悬浮细胞生长和黄芩苷积累量有关，在黄芩愈伤组织生长周期的前6 d，细胞处于缓解期，表现为细胞的生长量、黄芩苷的合成量以及蛋白质的合成量，都比较缓慢；到6～18 d时三者都增加；到18 d后，由于培养基中营养成分的逐渐消耗，表现为细胞生物量增长缓慢，黄芩苷的含量和蛋白质的含量逐渐达到稳定状态。通过数据分析和正交试验验证了以上的规律性。可以看出，在黄芩悬浮细胞的生长过程中，蛋白质的含量与黄芩愈伤组织成长和黄芩苷积累有一定的相关性。

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