冬虫夏草浸出液合用硫唑嘌呤对大鼠肝移植后免疫调节的影响

邹佩霞，李 敏，李 莉，王文杰，陈德森*

（1．十堰市太和医院儿科，湖北十堰442000；2．湖北医药学院，湖北十堰442000）

冬虫夏草浸出液合用硫唑嘌呤对大鼠肝移植后免疫调节的影响

邹佩霞1，李 敏1，李 莉2，王文杰1，陈德森2*

（1．十堰市太和医院儿科，湖北十堰442000；2．湖北医药学院，湖北十堰442000）

目的 观察冬虫夏草浸出液合用硫唑嘌呤对大鼠减体积1／2肝脏移植后免疫调节功能的影响。方法 80只大鼠，随机分为空白对照组、模型组、硫唑嘌呤组、冬虫夏草组，采用改良双袖套法进行1／2大鼠同种异体减体积原位肝脏移植，术后硫唑嘌呤组用硫唑嘌呤稀释溶液灌胃1.0 mg／（kg・d）、冬虫夏草组用6%冬虫夏草浸出液（10 mL／kg）加硫唑嘌呤1.0 mg／（kg・d）灌胃。于治疗21 d后，测定肝微粒体细胞色素P450亚型酶（CYPIA2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4）活性，血清总蛋白、白蛋白、血红蛋白，静脉血红细胞、白细胞、T淋巴细胞、单核细胞数量，受体大鼠感染率。结果 冬虫夏草浸出液明显抑制存活受体大鼠P450亚型酶CYPIA2（0.68±0.09）、CYP3A4酶的活性（4.92±0.27），降低静脉血红细胞（6.71±0.87）、白细胞数量（10.36±0.09），提高血清总蛋白（19.39±4.93）、白蛋白（14.27±4.45）及血红蛋白含量（19.39±4.973），明显降低受体大鼠感染率40.87%。与硫唑嘌呤组比较，P＜0.05。对T淋巴细胞及单核细胞数量无明显影响，与硫唑嘌呤组比较，P＞0.05。结论 冬虫夏草浸出液在不影响硫唑嘌呤抑制肝移植排斥反应的同时，改善肝脏移植后低蛋白血症，提高体液免疫，对细胞免疫功能无明显影响，具有双向免疫调节作用。

大鼠；冬虫夏草浸出液；硫唑嘌呤；肝脏移植；免疫调节

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康SD大鼠80只，SPF级，9～l2周龄，体质量250～300 g，雌雄兼用，由湖北医药学院实验动物中心提供，实验动物设施使用许可证SYXK（鄂）2014-0031，实验动物生产许可证SCXK（鄂）2014-0008。采用随机数字表编号，随机分为空白对照组、模型组、硫唑嘌呤组、冬虫夏草组，每组20只，即供、受体和10只（对本组供、受体配对交叉原位1／2减体积肝移植）。

1.2 药品试剂及仪器 硫唑嘌呤片（常州亚邦制药有限公司，5mg／片，国药准字：H20053413）；冬虫夏草（购自十堰市太和医院中药房）；戊巴比妥钠（北京化学试剂公司，德国进口分装 ，批号：061222）；Waters2010型高效液相色谱仪（迪马公司）；双目连续变倍体视显微镜（上海严丰精密仪器有限公司，型号：YF501）；贝克曼库尔特AU5800全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司，型号：AU5800）；SHA-C水浴恒温振荡器（金坛市亿通电子有限公司）；CAY-1型液体快速混合器（北京长安仪器厂）；显微外科无损伤缝合线（宁波医用缝针有限公司，规格：10／0）；GR22GⅡ型高速冷冻离心机（美国Beck-man公司）；KQ-500E型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 大鼠肝脏移植手术方法 参照文献［3］，每对供、受体大鼠体质量相差≤15 g，供体及受体术前均禁食12 h，不禁水。术前10 min肌肉注射阿托品0.04 mg，分别对模型组、硫唑嘌呤组、冬虫夏草组用2%戊巴比妥钠（按45 mg／kg）麻醉。仰卧位固定，对同组供体及受体大鼠同时进行改良双袖套法（“4贯通、3结扎、2回折法”）手术，为保证大鼠动、静脉吻合精确，提高手术成功率，所有手术均在双目连续变倍体视显微镜下进行。受体自身肝脏切除与供体1／2减体积相同，原位置入受体腹腔进行配对交叉肝脏移植。术后分层关闭腹腔，碘伏消毒创口1周（1次／d），头孢克洛0.1 g，100 g／d肌肉注射预防感染（5 d），术后动物饲养应满足动物福利要求，动物房温度18～25℃，湿度50%～75%，大鼠单笼饲养，12 h交替光照使尽快复温，动物苏醒后自由饮水，普通饲料喂养，每日观察动物进食情况，称体质量，及时清理粪便，消毒护理时尽量减少动物的疼痛和不适等［4］。

1.4 冬虫夏草浸出液提取及治疗方法 参照文献［5］，乙醇提取法：在搅拌槽内，将50 g按1∶2～8重量比加入50%～95%乙醇，提取时间为1～24 h，提取温度为20～60℃；离心：将醇液与基质沉淀物进行固液分离，得到醇提液和沉淀物；醇提取液浓缩干燥：用减压蒸馏方法将醇提液浓缩至浆状，然后烘干，即得含虫草素和虫草酸的醇提物。使用时用注射用生理盐水稀释到6%，硫唑嘌呤用碾钵碾碎后用生理盐水稀释到1%。大鼠肝脏移植手术成功后，硫唑嘌呤组用1%硫唑嘌呤1.0 mL／（kg・d）灌胃；冬虫夏草组用6%冬虫夏草浸出液（10 mL／kg）加1%硫唑嘌呤1.0 mg／（kg・d）灌胃；对照组及模型组灌生理盐水（按10 mL／kg）。连续治疗21 d。

1.5 检测指标 参照文献［6］，在治疗21 d后，选择存活各组大鼠各10只，均经眶静脉采取血0.5 mL，测定血清总蛋白、白蛋白、血红蛋白，静脉血红细胞、白细胞，T淋巴细胞及单核细胞数量。动物断头处死取肝脏，4℃下9 000 r／min，离心20 min，取上清液肝微粒体体外孵育，37℃预孵育30 min，后取上清液用高效液相色谱仪进样检测CYPIA2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4。

1.6 统计学方法 数据处理采用SPSS 17.0统计软件，各组数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较均采用 t检验，以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冬虫夏草浸出液对肝微粒体细胞色素P450亚型酶的影响 见表1。

表1 冬虫夏草浸出液对肝微粒体细胞色素P450亚型酶的影响（±s，n＝10） nmol／mL

表1 冬虫夏草浸出液对肝微粒体细胞色素P450亚型酶的影响（±s，n＝10） nmol／mL

注：与模型组比较 ，＃P＜0．05；与空白对照组比较 ，△P＜0．05；与治疗前比较，▲P＜0．05；与硫唑嘌呤组比较 ，☆P＜0．05

组 别 感染率／% CYPIA2 CYP2C9 CYP2D6 CYP2E1 CYP3A4对照组 治疗前 0 1．57±0．15 2．34±0．13 4．58±0．15 1．57±0．13 6．59±0．25治疗后 0 1．42±0．11 2．40±0．08 4．57±0．10 1．53±0．15 6．49±0．30模型组 治疗前 1．53±0．17 2．38±0．15 4．57±0．12 1．54±0．14 6．55±0．21治疗后 8（80．23） 2．45±0．19△▲ 2．43±0．21 4．61±0．20 1．55±0．21 10．50±0．39△▲硫唑嘌呤组 治疗前 1．50±0．14 2．36±0．13 4．56±0．21 1．50±0．15 6．56±0．25治疗后 6（60．35）＃ 0．67±0．09▲＃ 2．29±0．20 4．54±0．17 1．49±0．17 5．02±0．33▲＃冬虫夏草组 治疗前 1．59±0．12 2．54±0．13 4．53±0．14 1．51±0．12 6．07±0．31治疗后 4（40．87）＃☆ 0．68±0．09▲☆ 2．65±0．07 4．55±0．24 1．47±0．16 4．92±0．27▲☆

2.2 冬虫夏草浸出液对肝移植大鼠免疫系统的影响见表2。

表2 冬虫夏草浸出液对肝移植大鼠免疫系统的影响（±s，n＝10）

表2 冬虫夏草浸出液对肝移植大鼠免疫系统的影响（±s，n＝10）

注：与模型组比较 ，＃P＜0．05；与空白对照组比较 ，△P＜0．05；与治疗前比较，▲P＜0．05；与硫唑嘌呤组比较 ，☆P＜0．05

治疗后红细胞／（个／μL） 8．56±0．65 8．61±0．73 8．28±0．74 7．83±0．85△▲ 8．97±0．83 6．59±0．54▲＃ 8．39±0．23 6．71±0．870▲☆白细胞／（个／μL） 12．25±2．10 12．22±2．16 12．27±2．16 10．20±2．19△▲ 12．32±3．19 9．94±2．12▲＃ 12．15±0．24 10．36±0．090▲☆单核细胞／% 2．39±0．29 2．50±0．32 2．32±0．27 4．30±0．22△▲ 2．59±0．33 1．75±0．34▲＃ 2．39±0．29 1．86±0．370 T淋巴细胞／% 73．33±5．21 73．56±5．37 71．10±5．29 87．37±6．49△▲ 69．59±5．97 43．76±5．07▲＃ 47．27±4．26 47．79±5．350总蛋白／（g／100mL）15．60±2．36 17．52±2．31 14．91±2．17 11．21±3．20△▲ 15．54±1．98 8．74±1．18▲＃ 16．22±3．03 19．39±4．930▲☆白蛋白／（g／100mL）11．39±2．81 13．24±2．15 12．61±2．73 9．27±2．24△▲ 12．73±2．20 5．27±1．79▲＃ 11．50±2．50 14．27±4．450▲☆血红蛋白／（g／100mL）14．60±7．36 15．52±6．31 14．91±2．17 11．21±3．20△▲ 15．54±1．98 7．74±1．18▲＃ 15．22±3．03 19．39±4．973项目 对照组治疗前 治疗后模型组治疗前 治疗后硫唑嘌呤组治疗前 治疗后冬虫夏草组治疗前▲☆

3 讨论

冬虫夏草（cordyceps sinensis，CS）是麦角菌科真菌寄生在蝙蝠娥科昆虫幼虫的子座及幼虫尸体上长成的虫草体与菌座复合体［7］，含有丰富的虫草多糖、氨基酸、核苷、多种微量元素及甾醇类，味甘、性温、归肾、肺经，养肺阴、补肾阳、止咳化痰、抗癌防老。现代药理研究［8］证实，其具有增强免疫力、抗肿瘤、降压、抗炎、免疫调节、保护肾脏和肝脏等作用。《本草从新》言其有“保肺、止血、化痰、益肾”之功效，是我国传统的滋补中药［9］。近年来在创伤、大手术、器官移植时作为免疫调节剂而被广泛应用［10］。其药理作用主要是提高机体免疫力、调控肾脏固有细胞增殖及细胞外基质合成，调节细胞因子及生长因子及改善机体代谢机制，减少尿蛋白、改善肾功能及减轻肾脏病理改变等作用［11-12］。

在肝移植术后，由于手术创伤及异体排斥反应，需要大量应用免疫抑制药及抗感染治疗，而这类药物均由细胞色素P450亚型酶代谢［13］。在本实验研究中 ，笔者采用P450亚型酶活性及总蛋白、白蛋白、血红蛋白、静脉血红细胞、白细胞、T-淋巴细胞及单核细胞数量，受体大鼠感染率等指标评定冬虫夏草浸出液对大鼠肝移植术后免疫调节功能的影响。结果显示，冬虫夏草组大鼠在治疗21 d后，CYPIA2及CYP3A4活性降低，这利于器官移植后抗排斥药硫唑嘌呤的代谢，减轻其不良反应，增加疗效。CYPIA2、CYP3A4酶主要在肝脏组织中表达，占肝脏P450蛋白含量的13%以上，与许多的药物代谢及药物的相互作用密切相关［12］。CYPIA2、CYP3A4酶的活性升高代表所使用的药物临床不良反应增加，疗效降低，故在临床使用时应尽量避免与经P450亚型酶代谢的药物联合应用，以免影响疗效。本实验研究证实冬虫夏草组具有降低P450亚型酶，减少不良反应的作用。静脉血红、白细胞，T-淋巴细胞及单核细胞数量明显降低，说明其不影响免疫抑制剂硫唑嘌呤抑制T-淋巴细胞的生成，降低T-淋巴细胞的吞噬作用［14-16］。本研究认为 ，冬虫夏草作为免疫调节剂，在不影响硫唑嘌呤抑制细胞免疫的同时，提高了机体的体液免疫功能，可使总蛋白、白蛋白及血红蛋白、血清IgG升高，对机体免疫系统具有双向调节作用，即在对实质器官进行选择性免疫抑制的同时，不降低机体体液免疫系统的免疫防御作用，明显降低了术后感染的发生率，是一种较理想的免疫调节剂。

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Cordyceps sinensis from leaching solution of azathioprine on regulating immune response after liver transplantation in rats

ZOU Peixia1，LI Min1，LI Li2，WANG Wenjie1，CHEN Desen2*

（1．Pediatric Department，Shiyan Taihe Hospital，Shiyan 442000，Hubei Province，China；2．Hubei Medical College，Shiyan 442000，Hubei Province，China）

Objective To observe the effects of cordyceps sinensis extract combined with azathioprine on rat reduced size liver 1／2 immune function after transplantation．Methods 80 rats are randomly divided into blank control group，model group，azathioprine，cordyceps sinensis group，1／2 of rat orthotopic liver transplantation with reduced size modified cuff technique，postoperative azathioprine azathioprine dilute solution by gavage 1．0 mg／（kg・d），Cordyceps sinensis extract group 6% （10 mL／kg）＋oral azathioprine 1．0 mg／（kg・d）by gavage．In 21 days of treatment（d），the determination of hepatic microsomal cytochrome P450isoforms（CYPIA2，CYP2C9，CYP2D6，CYP2E1，CYP3A4）activity，serum total protein，albumin，hemoglobin，red blood cells，white blood cells，T lymphocytes，the number of mononuclear cells，receptor of rat infection rate．Results Cordyceps sinensis extract significantly inhibites the survival rate of the recipient rat P450isoforms of CYPIA2（0．68±0．09），the enzyme activity of CYP3A4（4．92±0．27），lower vein red blood cells（6．71±0．87），the number of white blood cells（10．36±0．09），increased serum total protein，albumin（19．39±4．93）（14．27±4．45）and hemoglobincontent（19．39±4．973）is significantly lower in rats，the infection rate of 40．87% ．Compared with azathioprine（P＜0．05），the differences are statistically significant．There is no significant effect on the number of T lymphocytes and mononuclear cells，compared with azathioprine group，P＞0．05．Conclusion Cordyceps sinensis extract on azathioprine suppresses hepatic allograft rejection and at the same time，improve hypoproteinemia after liver transplantation，enhance humoral immunity，and has no significant effect on the cellular immune function，it has a dual immunomodulatory activity．

rats；cordyceps sinensis extract；azathioprine；liver transplantation；immune regulation大鼠同种异体1／2减体积原位肝脏移植为成熟的肝移植方法之一［1］，由Lee于1973年报道［2］，该动物模型可真实的反应肝移植术后机能排斥反应，为临床治疗提供可靠的实验数据。在本实验中，笔者采用改良双袖套法进行大鼠同种异体1／2减体积原位肝脏移植，系统观察了冬虫夏草浸出液合用硫唑嘌呤对肝移植术后大鼠免疫调节功能的影响，为其临床肝脏移植的治疗提供实验基础及理论依据。

R285.5

A

2095-6258（2015）05-0901-04

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．007

2015-02-10）

邹佩霞（1962-），女，主管护师，主要从事临床药理学与护理学研究。

*通信作者：陈德森，电话-18972486567，电子信箱-cdscds1226＠126.com