祛风通络方对阿霉素大鼠肾小球内皮细胞 VEGF及其受体 FLK-1表达的影响

王 娟，崔志军，马巧亚，王 竹，孙万森*

（1．西安交通大学医学院第二附属医院，中国皮肤性病学杂志编辑部，西安710004；2．陕西省交通医院急诊科，西安710004）

祛风通络方对阿霉素大鼠肾小球内皮细胞 VEGF及其受体 FLK-1表达的影响

王 娟1，崔志军2，马巧亚1，王 竹1，孙万森1*

（1．西安交通大学医学院第二附属医院，中国皮肤性病学杂志编辑部，西安710004；2．陕西省交通医院急诊科，西安710004）

目的 研究祛风通络方对阿霉素模型大鼠肾小球内皮细胞VEGF及其受体FLK-1表达的影响。方法 130只SD大鼠抽出30只作为空白对照组（A组），余下大鼠采用阿霉素给予尾静脉一次性注射构建大鼠肾病模型，造模成功后，随机分为模型组（B组，n＝18）、祛风通络方组（C组，n＝18），祛激组（祛风通络方和激素共用组，D组，n＝18），激素组（E组，n＝18），苯那普利组（F组，n＝18），构建肾小球内皮细胞阿霉素模型，给予相应大鼠血清治疗，邻苯三酚红／钼酸盐法检测24 h尿蛋白定量；全自动生化分析仪检测血清白蛋白（ALB）、血脂（TG）、肾功能BUN、Cr；Western Bloting及RT-PCR检测肾小球内皮细胞VEGF及其受体FLK-1的表达。结果

祛风通络方；VEGF；FLK-1；肾功能

慢性肾脏疾病（CKD）已成为世界范围内亟需解决的健康问题［1］，其患病率在10%左右［2］。中医药治疗CKD以“肾病从风论治”的理论有着独特的优势和特点，值得研究人员进一步探讨与发掘。祛风通络类方药被诸多肾病临床学者应用于慢性肾病的治疗，取得了确切疗效［3-4］。实验室前期的研究［5-9］证实 ，祛风通络方能够降低肾小球肾炎大鼠血清IL-6、IL-8水平，保护肾功能；抑制肾组织α-SMA的表达，从而影响肾小球系膜细胞的重塑，并能延缓肾小球硬化的进展等。然而，祛风通络方对肾小球内皮细胞受体信号传导系统知之甚少，本研究将构建大鼠肾病模型并于肾小球内皮细胞相结合，研究祛风通络方对VEGF及其受体FLK-1表达的影响。报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、细胞、药物与试剂 健康清洁级雄性SD大鼠130只，购于西安交通大学医学院动物实验中心（合格证号为陕医动字第09-005号）；4周龄H-2KbtsA58转基因小鼠购自CharleSRiver公司（USA）。祛风通络方稀释液（乌梢蛇15 g，黄芪30 g，青风藤20 g，桑寄生30 g，海风藤20 g，生地黄20 g）由西安交通大学第二附属医院中医科制剂室提供；醋酸强的松片：西安利君制药有限责任公司；阿霉素：浙江海正药业；苯那普利：北京诺华制药有限公司；血管内皮生长因子（VEGF）、VEGF受体（FLK-1）与β-actin-抗：Cell Signaling，USA；Trizol：Gibco，USA；RT-PCR试剂盒：MBI。

1.2 动物分组、模型制备与给药 SD大鼠130只，适应性喂养1周后，随机抽出30只为空白对照组（A组），余下100只按6 mg／kg给予尾静脉一次性注射阿霉素（ADR），制成病理模型，A组给予等容量生理盐水。3周后肾病模型造模成功，死亡10只。余下90只大鼠随机分为5组，每组18只，即模型组（B组）、祛风通络方治疗组（C组），祛激组（祛风通络方和激素共用组D组），强的松治疗组（E组），苯那普利治疗组（F组）。造模成功后，各组大鼠灌胃1次／d，另外给予自由饮食。A、B组给予2 mL蒸馏水；C组给予祛风通络方药液（含生药2.1 g／mL）和蒸馏水各1 mL；D组给予强的松药液（25 mg／kg）和祛风通络方药液各1 mL；E组给予强的松药液和蒸馏水各1 mL；F组给予苯那普利（0.34 mg／kg）和蒸馏水各1 mL。

1.3 肾小球内皮细胞的培养、模型制备与给药 A、B、C、D、E、F组给予相应药物灌胃，1次／d。C、D、E、F 4组大鼠用药14 d，于末次给药4 h后，各组随机抽取4只，断头取血，离心取血清，灭活并过滤后-70℃真空干燥成粉末，-20℃保存备用。分离H-2Kb-tsA58转基因小鼠的肾小球内皮细胞 ，于 33℃、IFN-γ（20 U／mL）诱导下培养，获得无限增殖能力［10］，即永生化温度敏感小鼠内皮细胞系HSMEC（heat-sensitivemouse endothelium cell）。阿霉素100 μg／mL加入培养的HSMEC，作用24 h。此后分为6组，分别加入A、B、C、D、E、F组的血清冻干粉培养48 h。

1.4 24 h尿蛋白测定 分别在注射ADR第0、1、2、3周将大鼠置于清洁代谢笼内，留取24 h尿液，采用邻苯三酚红／钼酸盐法检测24 h尿蛋白定量。

1.5 血清生化指标检测 分别在实验进行的第0、3、7周，随机选取各组大鼠8只，10%水合氯醛麻醉，分离腹主动脉，抗凝管采集5 mL动脉血，3 000 r／min离心20 min，收集血清，全自动生化分析仪检测血清白蛋白（ALB）、血脂（TCH、TG）、肾功能（BUN、Cr）。

1.6 Western Blotting检测VEGF、FLK-1蛋白的表达水平 提取各组细胞总蛋白，采用Western Blotting法检测VEGF、FLK-1蛋白的表达，用Quantity One软件测每条带光密度值。

1.7 RT-PCR检测VEGF、FLK-1 mRNA的表达 采用Trizol提取细胞总RNA，以RNA为模板，经逆转录酶及引物水浴30 min合成cDNA，95℃5 min灭活逆转录酶，产物作为PCR模板。VEGF引物序列：正链引物5′-ACTGGACCCTGGCTTTACTGC-3′，负链引物 5′-TTGGTGAGGTTTGA TCCGCA TG-3′，扩增产物长度为310 bp；FLK-1引物序列：正链引物5′-CGTCCTCAAAGCATCAGCAT-3′，负链引物 5′-CTACGCCCTTTGATGTGCCA-3′扩增产物长度为406 bp；内参β-actin：引物序列：正链引物5′-CTCTGGTCGTACCACTGGCATTG-3′，5′-CCTGCTTGCTGATCCACA TCTGC-3′扩增产物长度为680 bp。

1.8 统计学方法 采用统计软件SPSS 19.0进行分析，计量数据采用均数±标准差（±s）表示，多组之间采用单因素方差分析进行比较，以 P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组24 h尿蛋白测定比较 见表1。

表1 各组24 h尿蛋白测定比较（±s，n＝30）mg／24h

表1 各组24 h尿蛋白测定比较（±s，n＝30）mg／24h

注：与对照组相应时间比较 ，＃P＜0．05，＃＃P＜0．01

组 别 0周 1周 2周 3周对照组 7．91±2．02 8．11±1．98 8．36±2．31 7．88±2．13模型组 8．01±2．1118．34±6．45＃54．32±12．24＃＃68．62±11．31＃＃

2.2 各组血清生化指标检测比较 见表2。

表2 各组血清生化指标比较（±s，n＝8）

表2 各组血清生化指标比较（±s，n＝8）

注：与A组相应时间比较 ，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与B组相应时间比较 ，△P＜0.05，△△P＜0.01

组 别 时间／周 ALB／（g／L） TCH／（mmol／L） TG／（mmol／L） BUN／（mmol／L） Cr／（μmol／L）A组 0 30．80±1．46 1．95±0．39 2．30±0．91 5．78±1．09 45．30±8．61 3 30．47±0．93 2．00±0．32 2．47±0．95 5．99±0．92 45．13±5．65 7 30．77±1．15 1．98±0．31 2．77±0．57 6．03±0．89 48．43±8．07 B组 0 30．22±1．59 1．99±0．23 2．72±0．88 5．73±0．95 45．05±8．44 3 26．83±1．38＃＃ 6．83±1．38＃＃ 5．62±0．56＃＃ 6．73±1．07 58．49±7．12＃＃7 27．01±1．59＃＃ 6．24±1．11＃＃ 5．73±0．92＃＃ 6．92±0．87 56．68±8．89 C组 7 29．68±1．24△△ 3．98±1．08＃＃△△ 5．51±1．09＃＃ 5．73±0．77 49．61±9．33 D组 7 27．84±1．35＃ 3．78±1．06＃＃△△ 5．18±1．21＃＃ 5．92±0．82 50．95±9．12 E组 7 29．85±1．35△△ 3．18±1．22＃△△ 6．86±0．54＃＃△ 6．46±1．03 48．77±9．04 F组 7 27．75±2．31＃ 3．36±1．34＃△△ 5．42±1．04＃＃ 6．22±1．04 49．82±8．93

2.3 Western Blotting检测VEGF、FLK-1蛋白的表达水平 见图1。

图1 各组VEGF、FLK-1蛋白表达的比较

2.4 RT-PCR检测VEGF及FLK-1 mRNA的表达 见图2。

图2 各组VEGF、FLK-1mRNA表达的比较

3 讨论

蛋白尿是CKD的一个常见症状，也是较难解决的临床症状之一［11］。肾小球滤过屏障的破坏与蛋白尿的发生与有着密切的关联［12］，滤过膜由肾小球内皮细胞、基底膜和足细胞共同构成，研究［13］证实小鼠体内VEGF表达的异常，其滤过膜形成发生障碍，结果提示，VEGF的表达情况可能与滤过膜的形成过程及蛋白尿的发生有着密切的关系。另有研究［14］证实，在维持和调控肾小球滤过功能正常运行的方面，VEGF及其受体可能起着重要作用，并参与了实验性非糖尿病动物模型肾脏微血管结构的改变。

本实验在前期研究的基础上，采用ADR一次性给予大鼠尾静脉注射，3周后根据大鼠24 h尿蛋白含量的结果，提示成功构建大鼠肾病模型。本研究巧妙的运用给药后的大鼠血清作为治疗ADR损伤的内皮细胞的药物来源，避免了因直接加药所带来的不确定因素。观察VEGF及其受体FLK-1的表达，结果显示ADR损伤的内皮细胞VEGF、FLK-1蛋白及mRNA的表达均升高，提示ADR可能导致内皮细胞通透性的改变，给予相应的血清治疗后，VEGF、FLK-1蛋白及mRNA的表达有不同程度的下调，其中以祛风通络方及强的松下调效果显著。然而，肾上腺皮质类激素虽然在治疗肾病综合征方面有显著的效果，但由于其亦引起各种不良反应，在临床使用中非常谨慎。此外本研究结果亦表明祛风通络方在治疗大鼠肾病效果方面优于血管紧张素转化酶抑制剂苯那普利 ，祛风通络方联合激素治疗效果并不理想，其具体机制还不明确。这些结果表明，祛风通络方能够降低肾病大鼠模型的尿蛋白含量，改善肾小球内皮细胞的功能，在治疗肾病上有着显著的优势。

综上，祛风通络方能够下调肾小球内皮细胞VEGF及其受体FLK-1的表达，改善阿霉素大鼠肾病模型的肾功能，值得临床上进一步研究。

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Qufengtongluo recipe on expression of VEGF and its receptor FLK-1in adriamycin-induced rat glomerular endothelial cell

WANG Juan1，CUI Zhijun2，MA Qiaoya1，WANG Zhu1，SUN Wangsen1*
（1．The Newsroom of Chinese Journal of Dermatovenereology，Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，China；2．Emergency Department，Shanxi Traffic Hospital，Xi'an 710004，China）

Objective To study the effects of qufengtongluo recipe on the expression of VEGF and its receptor FLK-1 in adriamycin-induced rat glomerular endothelial cell．Methods The 30 out of 130 SD rats are used as the control group（A），and the remaining rats are given intravenously adriamycin one-time injecting to construct nephropathy model，and after the model is successfully constructed，rats are randomly divided into model group（B，n＝18），qufengtongluo eecipe group（C group，n＝18），qufeng and hormone group（qufengtongluo recipe and hormones share group，D，n＝18），hormone group（E，n＝18），benazepril group（F，n＝18），to build adriamycin-induced glomerular endothelial cells models，and to give the appropriate serum for treatment，and pyrogallol red／molybdate method is used to detect 24 h urinary protein；automatic biochemical analyzer is used to detect serum albumin（ALB），lipids（total cholesterol，TCH；Triglycerides，TG），renal function（blood urea nitrogen，BUN；serum creatinine，Cr）and RT-PCR；western bloting and RT-PCR are used to detect the expression of VEGF andFLK-1 in the cells．Results Both C，E group can elevate serum ALB，decrease serum TCH，and the differences are significant comparing with group B（P＜0．01）；after glomerular endothelial cells are damaged by ADR，the expression of VEGF and FLK-1proteinand mRNA in group B is higher than that in group A，the difference is significant（P＜0．01），and after adding the appropriate serum lyophilized powder，the expression of VEGF and FLK-1 protein and mRNA in group C，E are down-regulated compared with group B（P＜0．01）．Conclusion Qufengtongluo recipe can decrease expression of VEGF and its receptor FLK-1 in glomerular endothelial cells，and improve renal function in rats with Adriamycininduced nephropathy model．

Qufengtongluo recipe；VEGF；FLK-1；renal function

R285.5

A

2095-6258（2015）05-0897-04

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．006

2015-02-25）

陕西省科技计划项目基金（2004K16-G9）；西安交通大学基本科研业务费自由探索与自主创新类项目（08143035）；西安交通大学医学院第二附属医院院基金重点项目〔YJ（ZD）201203〕。

王 娟（1980-），女，硕士，主治医师，主要从事中西医结合肾病方向研究。

*通信作者：孙万森，男，硕士，主任医师，电话-15829282087，电子信箱-wangjuan8002＠126．com

C、E组能升高大鼠血清ALB的含量，降低血清TCH的含量，与B组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；肾小球内皮细胞经阿霉素损伤后，B组较A组VEGF、FLK-1蛋白及mRNA的表达均升高，差异有统计学意义（P＜0.01），各组加入相应血清冻干粉后，C、E组VEGF、FLK-1蛋白表达均下调，与B组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 祛风通络方能够下调肾小球内皮细胞VEGF及其受体FLK-1的表达，改善阿霉素大鼠肾病模型的肾功能。