禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)原生质体制备与再生的研究

张德珍, 陈晓霞, 高先悦, 于金凤*

(1.山东农业大学植物保护学院植物病理学系, 泰安 271018; 2. 潍坊科技学院, 寿光 262700)



禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)原生质体制备与再生的研究

张德珍1,2, 陈晓霞1, 高先悦1, 于金凤1*

(1.山东农业大学植物保护学院植物病理学系, 泰安 271018; 2. 潍坊科技学院, 寿光 262700)

禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)是引起我国小麦纹枯病的主要致病菌。为了建立高效稳定的禾谷丝核菌遗传转化体系,本试验比较研究了不同细胞壁降解酶、酶液浓度、酶处理温度和时间等因素对禾谷丝核菌原生质体制备的影响,利用正交设计试验优化了原生质体再生条件。结果表明,液体培养6 d的菌丝,采用15 mg/mL溶壁酶+10 mg/mL蜗牛酶组成的混合酶液,30 ℃下酶解4 h,可以获得较高的原生质体释放量,可达到3.0×106个/mL;禾谷丝核菌原生质体再生的最佳条件是以SuTC缓冲液作为渗透压稳定剂悬浮原生质体,采用单层混菌法接种于TB3再生培养基,原生质体再生率可达到58.6%。禾谷丝核菌原生质体制备和原生质体再生条件的优化,为深入研究禾谷丝核菌生长发育的分子遗传学基础和进一步探索小麦纹枯病的致病机理奠定了基础。

禾谷丝核菌; 原生质体; 制备; 再生

小麦纹枯病,又称小麦尖眼斑病(wheat sharp eyespot),是由丝核菌属(Rhizoctonia)真菌引起的土传性真菌病害。早在20世纪70年代初我国就有报道[1]。近年来,随着肥水条件的改良和耕作制度的调整,以及大面积推广的小麦栽培品种对纹枯病的抗性普遍较差,小麦纹枯病已成为威胁我国小麦产量的主要病害之一。

目前我国小麦纹枯病的主要病原菌为禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis),属于AG-D融合群(即CAG-1融合群)[2-6]。目前对于R.cerealis致病机理的研究,主要集中在细胞组织学[7]和细胞壁降解酶的研究,Cooper等[8]对R.cerealis产生的多糖降解酶进行了系统研究,在接种R.cerealis的小麦活体内外分别检测到了阿拉伯聚糖酶、木聚糖酶、昆布多糖酶(即β-1,3-葡聚糖酶)等十多种酶的活性,认为R.cerealis产生的胞外酶能降解细胞壁使其释放出阿拉伯糖和木糖。Chen 等[9]认为R.cerealis侵入小麦后,通过破坏小麦的维管束组织和其他组织导致营养物质运输受阻而发生病变。但由于R.cerealis的营养体为双核菌丝,遗传特性复杂,加之该菌在人工培养条件下难以产生有性和无性孢子,使得对该菌的分子遗传学和致病机制的研究相对滞后。因此,应用原生质体技术,建立高效的遗传转化体系,有利于了解R.cerealis的生长发育与致病过程的分子遗传学基础,为进一步探索小麦纹枯病的致病机理奠定基础。

国内外对水稻纹枯病立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)原生质体制备与转化的研究较多[10-14],而对于小麦纹枯病禾谷丝核菌(R.cerealis)的相关研究报道较少。2013年任向荣等[15]建立了禾谷丝核菌高效、稳定的原生质体制备体系,并发现原生质体再生菌株和原始菌株之间的形态学、生长速率及致病性差异不显著,但未能成功获得禾谷丝核菌的遗传转化子。本文以R.cerealis菌株WK-206为研究对象,探索了R.cerealis原生质体制备的方法并优化了原生质体再生的条件,为进一步建立有效的禾谷丝核菌遗传转化体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

小麦纹枯病禾谷丝核菌(R.cerealis)菌株WK-206,由本实验室从小麦纹枯病病株上分离、鉴定并保存。

1.1.2 细胞壁裂解酶

溶壁酶(lywallzyme)购自广东碧德生物技术有限公司;Glucanex购自诺维信公司;纤维素酶(Cellulase-R-10)购自北京经科宏达生物技术有限公司;裂解酶(lytic enzyme)购自Sigma-Aldrich公司;蜗牛酶(snailase)购自索莱宝生物科技有限公司。细胞壁裂解酶液用0.7 mol/L NaCl溶液配制,经0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌,于-70 ℃保存备用。

1.1.3 原生质体再生培养基

TB3培养基：蔗糖200 g,酵母提取物3 g,酸水解酪蛋白3 g,琼脂15 g,水1 000 mL,pH自然;完全培养基：葡萄糖 60 g,蛋白胨20 g,酵母膏 10 g,琼脂15 g,水1 000 mL,pH 6.0;OCM培养基：硝酸钠6 g,微量元素混合液1 mL,复合维生素液1 mL,葡萄糖10 g,蛋白胨2 g,酵母提取物1 g,酪蛋白1 g,琼脂15 g,蔗糖239.6 g,水1 000 mL, pH 6.5。

1.1.4 原生质体渗透压稳定剂

STC缓冲液：山梨醇200 g,0.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)100 mL,CaCl2·2H2O 1.5 g,水1 000 mL,;SuTC缓冲液：蔗糖200 g,0.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)100 mL,CaCl2·2H2O 1.5 g,水1 000 mL;0.7 mol/L NaCl：NaCl 40.9 g,水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌丝体的收集与原生质体的制备

经活化的禾谷丝核菌WK-206,取其前端幼嫩菌丝接种于铺有灭菌玻璃纸的PDA平板上,置于25 ℃恒温培养4～5 d,将菌丝刮下捣碎后,接种于100 mL PD液体培养基中,25 ℃下160 r/min振荡培养6 d,用2层无菌纱布过滤收集菌丝,0.7 mol/L NaCl冲洗2～3次,5层滤纸吸干多余水分。

称取菌丝,按5 mL酶解液裂解1 g菌丝(湿重)的比例添加酶液,30 ℃ 100 r/min振荡酶解4 h,酶解液用4层擦镜纸过滤,取滤液在显微镜下用血球计数板计数,试验重复3次。采用DPS3.01软件进行数据统计和差异显著性分析。

1.2.2 禾谷丝核菌原生质体释放及形态观察

禾谷丝核菌WK-206菌丝在酶液中处理1 h后,吸取含菌丝的酶解液在Nikon-ECL IPSE90i显微镜下观察原生质体形态及其释放过程,并拍照。

1.2.3 原生质体接种方式

单层混菌法：将适量的原生质体悬浮液加到冷却至40～50 ℃的再生培养基中,混匀后倒入灭菌的培养皿中;单层涂菌法：将原生质体悬浮液滴到已冷却凝固的再生培养基平板上,用灭菌的涂布棒轻轻涂布均匀;双层混菌法：将原生质体悬浮液加入冷却至40～50 ℃的再生培养基中,混匀后倒入已冷却凝固的下层再生培养基平板上铺平。

1.2.4 原生质体再生条件的优化

经酶裂解并过滤的禾谷丝核菌原生质体悬浮液于4 ℃、6 000 r/min离心8 min,用0.7 mol/L NaCl清洗原生质体1～2次,用稳渗剂重悬原生质体并稀释到浓度为1×103个/mL。按每皿0.1 mL(即每皿100个原生质体)的接种量接种于原生质体再生培养基上,每处理接种3皿,25 ℃恒温培养。自肉眼可见再生菌落出现开始,每天累加计数新产生的菌落,并在培养皿的底部标记，避免重复计数,直至约7 d后菌落连成片,无法观察到新生菌落为止。对照组以无菌水代替稳渗剂重悬并稀释原生质体,可将已脱壁的原生质体胀破而无法再生,因此对照组再生培养基上长出的菌落是原生质体悬浮液中残留的未脱壁的断裂菌丝生长所产生。按以下公式计算小麦纹枯病菌原生质体的再生率：

再生率(%)=(处理组菌落平均数-对照组菌落平均数)/接种原生质体总数×100。

采用L9(34)正交表,分析渗透压稳定剂种类(0.7 mol/L NaCl、STC和SuTC)、再生培养基种类和接种方式3个因素对禾谷丝核菌WK-206原生质体再生的影响,对原生质体再生条件进行优化。试验因素和水平见表1。

2 结果与分析

2.1 禾谷丝核菌原生质体制备条件的确定

2.1.1 细胞壁降解酶及其组合对禾谷丝核菌原生质体释放的影响

5种细胞壁降解酶均在酶浓度20 mg/mL、反应温度30 ℃的条件下裂解菌丝4 h,表2的结果显示,在以0.7 mol/L NaCl为稳渗剂的条件下,溶壁酶对禾谷丝核菌细胞壁的裂解效果最好,酶解液中原生质体的浓度可达到2.56×106个/mL,且与其他4种酶之间的差异显著。其次为蜗牛酶和Glucanex,原生质体浓度分别为6.61×105个/mL和3.61×105个/mL,裂解酶产生的原生质体较少,为2.22×104个/mL,而纤维素酶处理的菌丝未见原生质体释放。

1) 各种酶用量均为20 mg/mL,同列数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。下同。

The concentration of each enzyme is 20 mg/mL.Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level. The same below.

选择单酶处理释放原生质体效果较好的溶壁酶和蜗牛酶,以不同浓度组合配制成混合酶液,进一步测定混合酶液对禾谷丝核菌细胞壁的降解效果,期望得到裂解效果更佳的混合酶液组合。表3结果显示,在30 ℃下，混合酶液15 mg/mL溶壁酶+10 mg/mL蜗牛酶裂解4 h的降解效果最好,且原生质体产量与20 mg/mL溶壁酶单酶液处于同一数量级。由于与蜗牛酶相比溶壁酶价格较高,而混合酶液可在保证原生质体产量的基础上降低溶壁酶的用量。同时考虑到降解效果和试验成本,确定选择15 mg/mL溶壁酶+10 mg/mL蜗牛酶组合为禾谷丝核菌原生质体制备的最佳酶液。

表3 不同溶壁酶+蜗牛酶浓度组合对R.cerealis原生质体产量的影响

2.1.2 酶解温度对禾谷丝核菌原生质体释放的影响

以15 mg/mL溶壁酶+10 mg/mL蜗牛酶混合酶液分别在27、30、33和36 ℃下处理禾谷丝核菌的菌丝,保温4 h后取酶解液进行原生质体计数,每个处理3个重复。由图1可见,酶液在30 ℃条件下可以达到最佳的催化裂解禾谷丝核菌细胞壁的效果,释放的原生质体数量最多,且与其他3组处理比较差异显著。

图1 不同酶解温度对R.cerealis原生质体产量的影响Fig.1 Effects of different treatment temperatures on the yield of R.cerealis protoplasts

2.1.3 酶解时间对禾谷丝核菌(R.cerealis)原生质体释放的影响

用15 mg/mL溶壁酶+10 mg/mL蜗牛酶混合酶液制备R.cerealis原生质体,30 ℃下处理1 h,即有原生质体开始释放,处理4 h,原生质体释放量可达到3.04×106个/mL。随着酶解时间的延长,原生

质体的浓度开始下降,推测可能是由于酶解时间过长,导致已释放的原生质体开始破裂死亡,从而造成原生质体产量的下降。由图2可确定在本试验条件下,酶解4 h是获得原生质体较理想的时间。

图2 不同酶解时间对R.cerealis原生质体产量的影响Fig.2 Effects of different digestion times on the yield of R.cerealis protoplasts

2.2 禾谷丝核菌R.cerealis原生质体的形成

在禾谷丝核菌原生质体的制备过程中发现,经酶液处理1 h后,原生质体开始释放。禾谷丝核菌原生质体主要从菌丝尖端吐出和从菌丝侧面溢出两种方式进行释放(图3a～b)。完全脱壁的原生质体呈球状(图3c)。

图3 R.cerealis原生质体释放过程Fig.3 The modes and morphology of protoplasts releasing from R.cerealis

2.3 影响禾谷丝核菌原生质体再生因素的分析

采用L9(34)正交表,安排试验,分析渗透压稳定剂(0.7 mol/L NaCl、STC和SuTC)、再生培养基和原生质体接种方式3个因素对禾谷丝核菌原生质体再生的影响,每个处理3个重复,取3个重复的平均值进行方差分析。

在表4中,极差(R值)分析可以看出,各因素对原生质体再生率的影响主次顺序依次为：再生培养基(C)>接种方式(B)>渗透压稳定剂(A),再生培养基(因素C)是影响原生质体再生率的主要因素。方差分析结果表明,3种再生培养基对原生质体再生的影响差异显著,其中以C1,即TB3再生培养基再生效果最好。接种方式(因素B)的1水平和2、3水平之间也存在显著差异,以第一种接种方式即单层混菌法效果最好。稳渗剂(因素A)的3个不同水平对原生质体再生作用的影响较小,三者间差异不显著,但以SuTC稳渗剂(A2)的效果较好。结合后续遗传转化条件的需要进行综合分析,选择原生质体再生的优化条件组合为A2B1C1,即以SuTC缓冲液为稳渗剂,采用单层混菌法接种于TB3再生培养基。后续试验证明,在这种条件下,禾谷丝核菌原生质体再生率可达58.6%。图4为禾谷丝核菌原生质体在PDA平板上再生菌落的形态。

表4 R.cerealis原生质体再生结果分析表1)

1) 同列数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著;R为同一列中不同水平所得平均结果的极差;K表示每列中同一水平对应的试验结果之和;k为每列水平对应试验结果总和的平均数;D为空白列。

Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level；Rindicates the range of average results in the same column obtained from different levels;Krepresents the summation of results from the same level in each column；krepresents the average value of the results from the same level in each column;Drepresents blank column.

图4 禾谷丝核菌原生质体再生菌落培养不同时间后形态Fig.4 The morphologies of protoplast-regenerated colonies of R.cerealis cultured for different days

3 讨论

本研究优化了禾谷丝核菌(R.cerealis)原生质体制备及再生的方法,确定原生质体再生条件为：收集液体培养6 d的禾谷丝核菌菌丝,采用15 mg/mL溶壁酶+10 mg/mL蜗牛酶组成的混合酶液,按酶液∶菌丝(湿重)=5∶1的质量比混合,在30 ℃,100 r/min的条件下,酶解4 h,原生质体释放量可达到3.04×106个/mL;禾谷丝核菌原生质体再生的优化条件为：以SuTC为稳渗剂悬浮原生质体,单层混菌法接种于TB3再生培养基,于25 ℃培养5～10 d,这种条件下,禾谷丝核菌原生质体的再生率较高,可达58.6%。

有关酶的种类和浓度、酶解温度与时间、菌龄、渗透压稳定剂、pH等因素对水稻纹枯病立枯丝核菌R.solani原生质体制备与再生影响的研究已有一些报道,而很少见到针对禾谷丝核菌R.cerealis原生质体制备与再生的相关报道。Robinson等[10]比较了14种单酶和10种混合酶的酶解效果,发现Novozyme 234对R.solaniAG 3的酶解效果最佳,原生质体产量可达2.02×106个/mL。杨迎青等[14]发现纤维素酶、溶菌酶、崩溃酶3种酶以1∶1∶1的比例组合,混合酶液终浓度为10 mg/mL时对R.solani菌丝细胞壁的酶解效果最佳,原生质体产量可达4×107个/g菌丝。孔丹丹等[13]研究发现用15 mg/mL Glucanex和10 mg/mL溶壁酶组成的混合酶处理,可高效降解水稻纹枯病菌细胞壁,原生质体产量达3.09×107个/g菌丝,原生质体再生率可达58%。在本研究的单酶裂解试验中,在酶浓度均为20 mg/mL的条件下,以溶壁酶的细胞壁降解效果最好,这与任向荣等[15]的结果一致。溶菌酶实质上是一种复合酶,研究表明,针对特定的真菌,多种酶的组合共同作用可以促进细胞壁的裂解和增加原生质体的产量[16-18],因此推测这可能是溶壁酶裂解R.cerealis细胞壁效果较好的一个重要原因。

张卉等[19]在选择适宜姬松茸原生质体制备的酶系统时发现,与单酶液处理相比,以1.5 %溶壁酶与0.5 %蜗牛酶和0.5 %纤维素酶组成的酶系统效果最好,本试验也进行了混合酶液试验,旨在寻找裂解效果更佳的组合,结果显示混合酶液与溶壁酶单酶液均可高效降解禾谷丝核菌细胞壁并可获得大量原生质体,而两者的裂解效果差异不大,考虑到混合酶液减少了溶壁酶的使用量,相较于使用20 mg/mL溶壁酶可有效降低试验成本,因此在本试验条件下,最终确定了选用混合酶液,并以15 mg/mL溶壁酶+10 mg/mL蜗牛酶为最佳混合酶液的配比浓度。

不同种属微生物原生质体的制备对菌龄的要求不同。前人研究表明,生长旺盛的菌体原生质体产量较大[20-22],为使菌体细胞易于原生质体化,一般选择对数生长期的菌体制备原生质体[23]。菌龄也会影响原生质体的生理状况,只有从成熟菌丝中释放的原生质体,才具有较完善的生理功能和较强的自我恢复能力,更有利于细胞壁的再生[24]。杨迎青等[14]、孔丹丹等[13]的研究中,Rhizoctoniasolani(属于AG-1-ⅠA融合群)以液体培养36 h为最适菌龄。R.cerealis属于AG-D融合群,由于自身遗传特性的原因,菌丝生长速度较慢,本试验采用PD液体培养基振荡培养R.cerealis,6 d达到对数生长期,可以获得足量的菌丝,菌丝产量大大高于固体平板培养。并且菌丝球直径相对较小(直径约1 mm),有利于酶解液的渗透和裂解。原生质体再生试验也表明,6 d菌龄也适于原生质体的再生。

在酶解时间方面,任向荣等[15]用2%的溶壁酶处理培养44 h的禾谷丝核菌幼嫩菌丝,1.5 h是收获原生质体的最佳时间。陈孝仁等[25]用Driselase和Lysing酶的混合液消解大豆疫霉(PhytophthorasojaeKaufmann & Gerdemann)细胞壁时,处理3 h效果最好,周庆新等[26]在利用0.15 mol/L溶壁酶制备疏绵状嗜热丝孢菌原生质体时需酶解4 h,Hashiba等[27]和张天晓等[28]认为酶解立枯丝核菌3 h后原生质体的产率几乎保持稳定。不同报道之间的差异可能是由于试验中所用酶的种类、渗透稳压剂或供试菌株种类和菌龄的不同所致。本试验中酶解开始1 h即有原生质体通过菌丝顶端吐出和侧面溢出两种方式释放出来,4 h时原生质体释放量达到最大,酶解时间超过4 h,原生质体产量下降,这可能由于酶长时间作用于已释放的原生质体,影响了质膜的稳定性,破坏了膜系统,导致原生质体破裂,数量减少。

在影响原生质体再生的诸多因素中,很少见到关于接种方式对原生质体再生影响的讨论。本研究中,单层混菌法接种原生质体的再生率最高,且与另外两种接种方式差异显著。同时作为遗传转化的试验基础,单层混菌法也是操作上相对简便的一种原生质体接种方式。在原生质体再生的过程中,渗透压稳定剂主要起维持质膜系统渗透压的作用,本文测定的3种稳渗剂对禾谷丝核菌原生质体再生率的影响差异不显著,考虑到后续遗传转化试验的需要[29],最终确定以SuTC缓冲液为最适的渗透压稳定剂。再生培养基除了需要具备丰富的营养之外,也要维持稳定的渗透压,与渗透压稳定剂共同对原生质体的形态起到保护作用,以维持原生质体的正常生理状态。综合以上因素,经正交试验和方差分析,确定以SuTC缓冲液为稳渗剂悬浮R.cerealis原生质体,并采用单层混菌法接种于TB3再生培养基,经后续试验验证,通过这种方法原生质体的再生率较高,可达58.6%。

原生质体技术的发展,促进了丝状真菌遗传转化研究和分子生物学研究的进步。目前,已可以从几乎所有的真菌类群中获得原生质体,但由于各种微生物细胞壁组成的差异,制备原生质体的条件也各不相同。对小麦纹枯病菌R.cerealis原生质体的制备和再生影响因素的探讨与研究,为后期遗传转化体系建立以及对该菌的分子遗传学和致病机制的研究创造了必要条件。

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(责任编辑：杨明丽)

Protoplast preparation and regeneration ofRhizoctoniacerealis

Zhang Dezhen1,2, Chen Xiaoxia1, Gao Xianyue1, Yu Jinfeng1

(1. Department of Plant Pathology, College of Plant Protection,Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China; 2. Weifang University of Science and Technology, Shouguang 262700, China)

Rhizoctoniacerealisis the main pathogen of wheat sharp eyespot in China. In order to obtain high-quality protoplasts for the transformation ofRhizoctoniacerealis, the factors influencing preparation ofR.cerealisprotoplasts were studied. The results showed that the suitable conditions for protoplast preparation were as followed: mycelia of 6 d, a mixture of 15 mg/mL lywallzyme and 10 mg/mL snailase, digested at 30 ℃ for 4 h The protoplast yield reached 3.0×106cell/mL.The optimal regeneration conditions forR.cerealisprotoplasts were as followed: SuTC as osmotic stabilizer, TB3 medium, inoculating by mixing the protoplasts with unsolidified medium. The protoplast regeneration rate could reach 58.6%. This study is an important foundation for exploring the molecular genetics of the development and pathogenic mechanism of this pathogen.

Rhizoctoniacerealis; protoplast; preparation; regeneration

2014-09-25

2014-12-11

国家自然科学基金(30870007)；山东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项资金(SDAIT-04-022-06)

S 435.121.49

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.016

* 通信作者 E-mail: jfyu@sdau.edu.cn