保护剂在益生菌保藏过程中的应用

王 岩，冯万宇，刘 宇，李 丹，王 爽，史同瑞

（黑龙江省兽医科学研究所，齐齐哈尔 161006）

保护剂在益生菌保藏过程中的应用

王 岩，冯万宇，刘 宇，李 丹，王 爽，史同瑞

（黑龙江省兽医科学研究所，齐齐哈尔 161006）

保护剂是影响益生菌活力最重要的外部因素，具有无免疫原性、无毒副作用、易溶解，能充分保持生物活性等特点，在益生菌保藏过程中可充分发挥其良好的保护效果。文章简单地介绍了保护剂的基本概念、分类情况，重点阐述了保护剂的作用机理和在益生菌保藏过程中的应用情况，并对保护剂的应用前景进行了分析和展望。

保护剂；益生菌；保藏；冷冻；干燥

益生菌是定植于人与动物体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效，从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。由于其较难长期保存，益生菌的保藏成了热门研究课题。

益生菌的保藏过程是一个多步骤过程，例如冷冻干燥会产生低温、冻结和脱水等多种效应；即使成功完成冷冻干燥过程后，在长期保藏过程中也很难保证冻干制品活性组分的稳定性。为了防止益生菌在冷冻干燥和贮藏过程中活性组分的变性，研究者们研究和探索了大量有效的保护添加剂。当益生菌添加保护剂时，可以有效改变冷冻干燥时菌体细胞所处的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥对菌体细胞的损害，使益生菌保持原有的理化特性和生物活性，因此保护剂有效利用已成为提高菌种存活率的关键技术［1］。不同的保护剂各有优缺点，单一保护剂不能满足菌体抵抗外界恶劣环境的条件，而复配保护剂中各保护剂在冷冻干燥中则均发挥着各自的作用，同时相互间又具有协同作用［2］，因而将各保护剂调整合适的比例及浓度进行复配，以达到对益生菌的最佳保护作用，才是研究者们今后研究和探索的方向。

1　保护剂概述及分类

保护剂也称稳定剂（stabilizer），是指一类能防止生物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。按分子量大小分为低分子化合物（lowmolecular compound）与高分子化合物（high molecular compound）；按其功能和性质可分为冻干保护剂（lyoprotectant）、抗氧化剂（antioxidant）、填充剂（lyoprotectant）、酸碱调整剂（pH modifier）（表1）；按物质的种类分类，可分糖/多元醇类（sugars/polyols）、聚合物类（polymers）、表面活性剂类（surfactants）、氨基酸类（aminoacids）、盐类（salts）（表2）。

表1　保护剂的分类（一）

表2　保护剂的分类（二）

2　保护剂的作用机理

保护剂对益生菌的保护作用与其化学结构有密切关系，目前普遍接受的机理主要是优先化理论、水替代假说与玻璃化假说。前者主要用于阐释在冷冻过程中保护剂的作用原理，后两者用于解释益生菌干燥过程中保护剂的作用机理。

优先化理论涉及两方面内容：一是优先水化，即蛋白质优先和水发生作用；二是优先排斥，保护剂优先从蛋白质表面进入溶液中，使其能在冷冻的过程中发挥保护蛋白质的作用［2］。此机理发挥保护作用的本质是提高蛋白质变性自由能，使蛋白质变性过程条件更加苛刻以阻止蛋白质变性［4］。由于在干燥过程中，蛋白质参与水合作用的单层外壳已经消失，故优先交互作用机制不复存在，因此许多在溶液中能稳定蛋白质的辅料在干燥过程中不再具有保护作用［5］。

玻璃态假说认为在冻干过程中，有些保护剂体系会随温度降低而使电解质形成一种粘度极大的非晶体的玻璃态，保护剂体系发生玻璃态转化的温度称为玻璃态转化温度［4］。研究表明，单糖、双糖、多羟基化合物以及结构蛋白质、酶等均能形成玻璃态，只是玻璃化转变温度不同。在玻璃态下，物质兼有固体和流体的行为，当干燥蛋白质药物时，保护剂可紧密地包裹相邻近的蛋白质分子，形成一种在结构上与冰相似的碳水化合物玻璃体，由于粘度高扩散系数低，蛋白质分子运动能力减弱，其亚稳态的构象互变及构象松弛减慢，大分子物质的链段运动受阻，使其伸展和聚集受到抑制，分子空间结构得到维持，从而起到保护作用。

水替代假说认为，在冻干过程中，由于糖类形成氢键能力较强，在氢键形成中既可作为孤对电子的受体，又可作为供体。因此，在冻干过程中，糖的羟基与蛋白质的极性基团形成氢键而代替蛋白质极性基团周围的水分子，使蛋白质表面形成一层假定的水化膜，这样可保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，稳定蛋白质的高级结构可防止蛋白质因冻干而变性，使其即使在低温冷冻和干燥失水的情况下仍保持其结构与功能的完整性。DePaz等［6］研究显示，双糖能通过形成氢键与枯草杆菌蛋白酶结合取代水的位置，阻止干燥诱导的变性。Santivarangkna等［7］通过红外光谱的方法发现，保护剂和蛋白质在冻干过程中形成了氢键，由于不同的保护剂和不同的蛋白质结构差别都较大，所以它们之间形成氢键的能力也不相同。例如麦芽低聚糖的保护能力随着二糖单位数量的增加而降低，这是由于蛋白质相互作用的羟基数量减少造成的［8］。

3　保护剂在益生菌保藏过程中的应用

在益生菌的保藏过程中，一种优良的保护剂应具备玻璃化温度高、吸湿性能和结晶速率低及不具有还原性基团等多种保护特性。单一保护剂的天然缺陷使其保护效果有限而致使其保护菌种不理想，研制复合型保护剂是当今乃至今后一段时间内益生菌保藏的重点方向和主要趋势之一。但由于复合保护剂研究必然涉及复配的种类和用量的要求，而且同一配方的复合保护剂对于不同菌种保护效果也不完全相同，所以正确的试验设计对于益生菌复合保护剂的筛选就显得非常重要了。

3.1保护剂在单一益生菌保藏过程中的应用

在单一益生菌保藏过程中，可采用糖类、醇类、聚合物类、氨基酸类以及盐类等物质作保护剂。不同种类的保护剂也各有优缺点，一些醇类虽对冷冻伤害有很好的预防作用，但由于吸湿性极强，一般不单独用作冻干保护剂。大分子保护剂只能外部保护细胞表面免受损伤，不能渗透到细胞内部使细胞内溶质的浓度升高，也不能减缓冰晶的生成从而减少冻干对细胞内部的损伤，所以大分子保护剂单独使用时，在保存期间对细胞的保护效果不明显［9］，另外，不同保护剂对不同菌种的保护效果也不尽相同，这就需要通过反复多次实验研究来确定效果最佳的复配保护剂。熊涛等［10］采用单因素和Box-Behnken响应面设计联用的方法筛选和优化植物乳杆菌NCU116真空冷冻干燥的保护剂配方的研究结果表明，海藻糖、D-山梨醇和脱脂奶粉3种保护剂效果好，能够显著提高菌种对冷冻干燥环境的耐受能力，以9.24%脱脂奶粉、4.47%海藻糖和13.42%D-山梨醇作为冻干保护剂配方进行验证试验，细胞存活率可达（91.76±1.82）%，与理论预测值相符。Tadanori等［11］通过对海藻糖溶液中冰晶生长速率和形态学的研究表明，海藻糖溶液中冰晶生长速率要比纯水中小得多，海藻糖抑制冰晶生长的能力是蔗糖的2倍。与蔗糖相比，它能显著抑制冰晶生成的形态不稳定性。他们认为这是由于海藻糖能结合更多的水分所致。

胥振国等［12］对冻干高活力纳豆芽胞杆菌菌粉保护剂进行筛选和优化，结果表明，纳豆芽胞杆菌的最佳冷冻干燥保护剂配方是脱脂乳粉10%、甘露醇4%、L-抗坏血酸钠1%，其存活率达91.63%。菌粉在－20℃、4℃、25℃下保存12个月后，存活率分别为88.79%、70.16%和10.52%，说明菌粉在－20℃和4℃下保存稳定性较好，25℃下保存稳定性较差。刘松玲等［13］为提高长双歧杆菌BBMN68的冷冻保藏效果，以冷冻存活率和菌株活力为评价指标，分别评价了4个类型的18种冷冻保护剂。结果表明，脱脂乳、海藻糖、果糖、甘油、维生素C、L-Glu能对BBMN68有效保护。采用二次回归正交设计对筛选的6种保护剂进行复配，得到复配保护剂的最优配方质量分数为甘油3%、海藻糖5%、果糖5%、脱脂乳8%、维生素C 0.05%、L-Glu 0.05%。在复配保护剂的作用下，－80℃保藏期间BBMN68菌数稳定，活菌对数值始终保持在105cfu/mL。冷冻浓缩物作为直投发酵剂应用于酸奶中，在21 d内菌数变化不大，始终保持在107cfu/mL以上。

王世宽等［14］采用单因素实验和响应面实验设计联用的方法，筛选优化植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌真空冷冻干燥的保护剂配方。单因素实验结果表明，脱脂奶粉、麦芽糖和谷氨酸钠3种保护剂效果较好，能够显著提高菌种对冷冻干燥环境的耐受能力。以细胞存活率为响应值，混合保护剂的最佳配方为脱脂奶粉7.06%、麦芽糖6.46%、谷氨酸钠6.70%，植物乳杆菌冷冻干燥存活率达92.95%，凝结芽孢杆菌的冷冻干燥存活率达94.1%。

3.2保护剂在混合益生菌保藏过程中的应用

在混合益生菌保藏过程中，也可采用糖类、醇类、聚合物类、氨基酸类、盐类等物质作为保护剂。由于混合益生菌是由几种菌组合而成，这就需要所筛选的复配保护剂组方必须同时满足几种益生菌的要求，才能达到最佳的保护效果。陈贺佳等［15］将嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌按3:2:1比例制备乳酸菌冻干保护剂。通过正交试验确定混合乳酸菌最佳保护剂配方为甘氨酸1.0%、脱脂乳10.0%、海藻糖7.0%、山梨醇1.0%。研究结果表明，冷冻干燥法制备的复合冻干保护剂对菌种保护效果优于单一保护剂。杜磊等［16］通过在保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌悬液中添加不同的保护剂，并测定了冷冻前后乳酸菌菌数，筛选出适用的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌的保护剂。最终确定的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌保护剂配方为10%蔗糖、10%脱脂乳、5%谷氨酸钠。菌体经冷冻处理后，冷冻存活率可达95.00%，比不添加保护剂的菌体存活率大大提高。

4　保护剂的应用前景

益生菌在冷冻干燥过程中容易造成部分菌体细胞的损伤、死亡及某些酶蛋白分子的钝化，因此，为了提高益生菌冻干后的存活率，冻干前必须加入保护介质来减少它的冻干损伤和增加蛋白质的稳定性。但蛋白质的稳定机制相当复杂，对蛋白质冻干制品的研究仍有待进一步深化。开发更优越的冻干保护剂，提高蛋白质药物冻干制品的质量仍是现今生物技术药物研究的重点与方向。在选择复配保护剂时，通常采用不同种类的保护剂才能获得显著的保护效果，而且选用尽可能少的辅料种类对实际生产有着重要意义。复配保护剂在冷冻干燥过程中发挥着各自作用的同时又具有相互协同作用，保护剂的比例及浓度达到协调时将会加速干燥，且能在干燥和保存期间维持较高的益生菌存活率，从而达到最佳保护效果，因此在选择保护剂时要综合考虑多种因素，尽量节约成本和减少工作量。相信随着研究的不断深入，益生菌保护剂的研究将具有更加广阔的应用前景，势必会对促进微生态制剂的健康发展起到积极的推动作用。

［1］ CarvalhoAS，Silva J，HoP，et a1.Survival offreeze-dried Lactobacillus Plantarum and Lactobacillus Ramnosus during storage in the presence ofprotectants［J］.BiotechnologyLetter，2002，24：1587-1591.

［2］ 袁亚宏，岳田利，高振鹏，等.冻干高活力乳酸菌粉保护剂的研究［J］.西北农林科技大学学报：自然科学版，2003，31（10）：82-84.

［3］ Timasheff S N.Control of protein ptabilityand reactions byweaklyinteractingcosolvents：the simplicityofthe complicated［J］.Protein Chem，1998，51：355-432.

［4］ 任艳，陈明，邵玉宇，等.真空冷冻干燥过程中保护剂对乳酸菌的保护机理［J］.中国乳品工业，2013，41（9）：41-45.

［5］ 孙东坡，胡一桥.蛋白质冷冻干燥制品中的保护剂及其保护机制［J］.药学进展，2003，27（4）：201-205.

［6］ Depaz R A，Dale D A，Barnett C C，et al.Effects of drying dethods and additives on the structure，function and storage stability of subtilisin：role of protein conformation and molecular mobility［J］.Enzyme and Microbial Technology，2002，31（6）：765-774.

［7］ Santivarangkna C，WenningM，Foerst P，et al.Damage of cell envelope oflactobacillus helveticus duringvacuumdrying［J］.Journal ofApplied Microbiology,2007，102（3）：748-756.

［8］Izutsu Ken-ichi，Aoyagi Nobuo，Kojima Shigeo.Protection of protein secondarystructure bysaccharides ofdifferent molecular weights duringfreeze-drying［J］.Chemical&Pharmaceutical Bulletin（Tokyo）,2004，52：199-203.

［9］ 张建国，张春晖，李凤彩，等.乳酸菌冻干伤害与保护［J］.食品工业科技，2003，24（1）：103-105.

［10］熊涛，黄锦卿，宋苏华，等.植物乳杆菌真空冷冻干燥保护剂配方优化［J］.南昌大学学报：理科版，2010，34（6）：561-565.

［11］Tadanori S，Takehiko G，Yoshiyasu A.Growth rate and morphology of ice crystals growing in a solution of trehalose and water［J］.Crystal Growth，2002，240（1-2）：218-229.

［12］胥振国，蔡玉华，向敏，等.冻干高活力纳豆芽胞杆菌菌粉保护剂的筛选和优化［J］.微生物学通报，2013，40（5）：822-828.

［13］刘松玲，蒋蔷莉，刘爱萍，等.长双歧杆菌冷冻保护剂筛选与优化［J］.农业机械学报，2010，41（4）：140-144.

［14］王世宽，洪玉程，袁先铃.响应面法优化植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌冻干保护剂的研究［J］.四川理工学院学报：自然科学版，2013，26（5）：23-26.

［15］陈贺佳，牟光庆.混合乳酸菌复合冻干保护剂的研究［J］.食品研究与开发，2013，34（18）：133-136.

［16］杜磊，乔发东.乳酸菌冷冻保护剂选择的研究［J］.乳业科学与技术，2010，142（3）：119-121.

Application of Protector in the Preservation of Probiotics

WangYan，FengWanyu，Liu Yu，et al
（HeilongjiangVeterinaryScience Institutes，Qiqihar 161006，China）

Protector was the capital outside factor which possessed specialty of an-immunogenicity，toxic and side-effect，easy deliquescence and kept thoroughly biological activity.It had satisfactory conservancy effectiveness in probiotic preservation.This text introduced the basic concept，systematic status and mechanism of action，utilization state of protecting agent.At the same time，the application perspective was analyzed and looked intothe future.

protector；probiotic；preserve；freezing；dessication

S816.7

A

2095-3887（2015）03-0052-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.03.017

2015-03-16

王岩（1976-），女，高级兽医师，大学本科，主要从事动物微生态制剂的研究工作。