三种黄酮清除自由基活性的研究*

邹淑君，许树军，付起风，徐 暘*

（黑龙江中医药大学a.药学院；b.实验中心，黑龙江哈尔滨150040）

三种黄酮清除自由基活性的研究*

邹淑君a，许树军b，付起风b，徐 暘a*

（黑龙江中医药大学a.药学院；b.实验中心，黑龙江哈尔滨150040）

为比较黄酮2、3位单双键不同及3'、4'邻位取代基不同对清除自由基活性的影响。采用UV-Vis光谱法测定了木犀草素、香叶木素及橙皮素对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、超氧阴离子自由基（·）的清除作用。结果显示3种黄酮化合物对两种自由基都有一定的清除作用，清除效果随浓度的增大而增大。但对自由基清除能力表现为木犀草素远强于香叶木素、香叶木素与橙皮素无显著差别。说明具有B环3'、4'邻二羟基结构的黄酮清除自由基的能力明显强于具有B环3'羟基、4'甲氧基结构的黄酮；黄酮C环2、3位单双键不同对自由基清除能力影响不显著。

黄酮；木犀草素；香叶木素；橙皮素；自由基；清除

自由基是机体正常代谢的产物，过量的活性氧会引起细胞的氧化及病变，从而造成机体的疾病、衰老等。因此，保证体内活性氧的含量处于正常水平是保证健康的重要前提。除了机体自身的调整，还可以通过摄入一些具有抗氧化性的物质来清除体内过多的活性氧，维持体内氧化和抗氧化的平衡。黄酮类化合物就是这样一类具有抗氧化活性的物质。测定黄酮类化合物体外清除自由基的能力，并研究结构与清除效果的关系，能够为黄酮类化合物在药物、食品及添加剂方面的选择和应用提供一定的理论支持。

黄酮因其结构中往往含有多个酚羟基及大的离域共轭性而显示明显的自由基清除活性，黄酮类化合物中的羟基数目、羟基的位置、C环的不同等结构差异都对自由基清除活性有明显的影响[1]，是值得深入探索的问题。为此，本研究利用DPPH自由基体系、邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子自由基体系，借助紫外-可见吸收光谱法进行测试，选取木犀草素、香叶木素及橙皮素这3种黄酮类化合物（结构见图1），考察黄酮清除自由基能力的构效关系。

图1 3种黄酮的结构式Fig.1 Structures of three flavonoids

1 实验部分

1.1 主要试剂、仪器

木犀草素、香叶木素及橙皮素（均为98%）（西安小草科技有限公司）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH日本东京化成株式会社）；三羟甲基氨基甲烷（Tris 99.8%上海博宏生物科技有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

PB-20型pH计（德国赛多利斯仪器有限公司）；SK250LH型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；XS105DU型电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；移液枪（美国Labnet公司）；UV-1601型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）的清除作用测定3种黄酮首先加少量甲醇溶解后，用去离子水定容配制成5.0×10-4mol·L-1的初始溶液。实验均以去离子水为参比，于517nm下测定。根据预实验效果，将5.0×10-4mol·L-1的橙皮素及香叶木素液按比例稀释获得4.0×10-4、3.0× 10-4、2.0×10-4、1.0×10-4、4.0×10-5及1.0×10-5mol· L-1的样品溶液供本实验用，将木犀草素溶液稀释获得3.0×10-4、2.0×10-4、1.0×10-4、7.5×10-5、5.0×10-5、2.5×10-5、1.0×10-5、7.5×10-6及5.0×10-6mol· L-1的样品溶液供实验用。

第一组试验取3mL去离子水与3mL 6.5×10-5mol·L-1的DPPH·溶液混合摇匀，于40℃恒温避光静置30min后测定吸光度A0为0.2667；第二组试验分别取3mL不同浓度的样品溶液，并分别加入3mL 6.5×10-5mol·L-1的DPPH·溶液，摇匀后于40℃恒温避光静置30min后测定吸光度Ai；第三组试验取3mL不同浓度样品溶液（与第二组样品对应）与3mL去离子水混匀后测吸光度

相同条件下，向10mL比色管加入pH值为8.2的Tris-HCl缓冲溶液5.0mL、浓度为4.0×10-4mol· L-1待测液分别为100、200、500、800、1000、1500、2000μL加去离子水定容至10mL，摇匀，做空白对照；另向10mL比色管加入pH值为8.2的Tris-HCl缓冲溶液5.0mL、同浓度的对应体积的待测液、及邻苯三酚溶液0.3mL、最后加去离子水定容至10mL，迅速摇匀后测定吸光度，每30s记录1次，直到反应启动3min结束。经计算处理获取加样品时邻苯三酚自氧化速率νc[4，5]。

2 结果与讨论

2.1 黄酮对DPPH自由基的清除作用

DPPH·溶液在517nm左右有特征吸收峰，当具有自由基清除能力的抗氧化剂存在时，由于抗氧化剂与DPPH·的单电子配对，继而使其吸收逐渐消失，且其褪色程度与其接受的电子数成定量关系，因此可用紫外-可见分光光度法进行定量分析，样品的抗氧化活性可以通过清除DPPH·的量来评价[6]。DPPH与抗氧化剂（AH）的反应如下式所示[7]：

DPPH·+AH→DPPH-H+A·

当有自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子由于被配对，DPPH·浓度减小而使其颜色变浅，在517nm波长处的吸光度会减小。根据计算样品溶液对DPPH·的清除率并作图（A0为不加黄酮的DPPH的吸光度值,Aj为黄酮溶液的吸光度，Ai为加入黄酮后的DPPH溶液的吸光度值）。图2即为3种黄酮类化合物对DPPH·的清除效果图。

图2 3种黄酮对DPPH·自由基的清除率Fig.2 Free radical scavenging rate of three kinds of flavonoids on DPPH·

由图2可以看出，木犀草素对DPPH·有很强的清除能力，橙皮素和香叶木素对DPPH·也有较好的清除能力，随着浓度的增加，清除率都呈上升趋势，即在试验浓度范围内呈现量-效关系。3种黄酮对DPPH·的半数清除率见表1。

表1 3种黄酮对DPPH·的半数清除率（Ec50）Tab.1 Ec50of Three kinds of flavonoids on DPPH·

黄酮类物质的抗氧化作用一般与其分子结构中的羟基数目及位置等结构因素有关，根据测试结果可以看出，被测的3种黄酮类化合物依据Ec50得到的清除DPPH·的能力的强弱顺序为：木樨草素远强于橙皮素；橙皮素略强于香叶木素，但差异不明显。相比之下，木犀草素在B环的3'和4'上的邻位羟基使其具有很强的清除能力，香叶木素的3'和4'位上的邻位羟基中的4'位羟基被甲氧基化，则对DPPH·的清除能力大大降低；C2~C3单双键不同的香叶木素和橙皮素相比，二者没有显著差异。

2.2 黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用

测试不加样品的邻苯三酚自氧化，初始记录吸光度值为0.063，然后每30s记录一次吸光度值，前3min的记录值分别是：0.172、0.262、0.336、0.399、0.450、0.493。以时间为横坐标，322nm处吸光度为纵坐标，利用OriginPro8.5软件进行数据线性回归计算处理得到其斜率即为邻苯三酚自氧化速率ν0=0.00201s-1。

测试加样品的邻苯三酚自氧化，以初始记录为起点，然后每30s记录一次吸光度值，取前3min的记录值，以时间为横坐标，322nm处吸光度为纵坐标。利用OriginPro8.5进行处理得到加入不同浓度的样品后的邻苯三酚自氧化速率νc。按实验用量计算测试时样品浓度，根据清除率P=（[ν0-ν）c/ν0]× 100%计算，得各浓度下不同样品对超氧阴离子自由基的清除率并作图，图2为3种黄酮对·自由基清除作用效果图。

图3 3种黄酮对·自由基的清除率Fig.3 Free radical scavenging rate of three kinds of flavonoids on

从图3可以看出，3种黄酮对超氧阴离子自由基都具有显著的清除能力，在测试浓度范围内，清除率也呈浓度依赖性。且相同浓度下木犀草素对超氧阴离子的清除率明显高于其它两种。表2是3种黄酮对·自由基的半数清除率数据。

表2 3种黄酮对·自由基的半数清除率（Ec5）0Tab.2 Ecof Three kinds of flavonoids on·50

表2 3种黄酮对·自由基的半数清除率（Ec5）0Tab.2 Ecof Three kinds of flavonoids on·50

Ec50（mol·L-1）橙皮素9.09×10-5香叶木素8.49×10-4木犀草素4.31×10-6

3 结论

通过对比实验，证明木犀草素、香叶木素、橙皮素对DPPH·、·都具有一定的清除作用。且随着浓度的增加，清除率呈上升趋势，即呈现量-效关系。清除DPPH·和·的能力均显示木犀草素明显强于香叶木素及橙皮素；而香叶木素与橙皮素之间的差别不明显。从构效关系来分析，本实验研究的结果为：（1）C2~C3之间的单双键对DPPH·、·自由基清除能力影响不显著；（2）B环3'、4'位邻位羟基是对清除DPPH·、·自由基有突出作用的特征结构，其中4'位羟基被甲氧基化后，则对自由基的清除能力显著下降，这一点与文献报导相一致[8]。

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［2］刘帅涛,陶慧林,李锦艳.4种黄酮小分子对DPPH自由基的清除作用及构效关系研究［J］.分析测试学报,2012,31（1）:71-75.

［3］熊双丽,卢飞,史敏娟,等.DPPH自由基清除活性评价方法在抗氧化剂筛选中的研究进展［J］.食品工业科技，2012，（8）：380-383.

［4］万军,黄国钧,周霞.邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中检测波长的优化［J］.安徽农业科学，2010，38（14）:7315，7381.

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［6］李春阳,许时婴,王璋.DPPH法测定葡萄籽原花青素清除自由基的能力川［J］.食品与生物技术学报，2006,25（1）:102-106.

［7］Piljac-Zegarac J.，Valek L.，Martinez S，et a1．Fluctuations in the phenolic content and antioxidant capacity ofbark fruitjuices in refrigerated storage［J］.Food Chemistry,2009,113（2）:394-400.

［8］钟建青,李波,贾琦,等.天然黄酮类化合物及其衍生物的构效关系研究进展［J］.药学学报,2011,46（6）:622-630.

图4 PEW热稳定性Fig.4 Thermal stability of PEW

可以看出，当温度达到220℃时仍然没有失重，230℃恒温30 min后失重仅有1.07%，达到266℃失重5.87%。说明通过水裂解制得的PEW有较高的热稳定性。

3 结论

（1）裂解温度对产品的影响最大，其次是反应时间的影响。裂解温度的升高和反应时间的延长都使得反应体系获得了更高的能量，容易使PE大分子发生断链从而得到低分子量PE，继而使产品性能发生了较大的变化。

（2）PEW产品的相对粘均分子量、熔程表现规律一致，即相对粘均分子量和熔程随裂解温度增加、时间延长而减小。在裂解温度为370℃，反应时间60min，溶剂加入量50%的条件下，得到白色粉末状的PEW，产品质量收率为91.93%，熔程在104~110℃，酸值为0.0143，粘均分子量为3426.4，且热稳定性较高，在220℃仍然没有失重，266℃仅失重5.87%，符合工业生产要求。

参考文献

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Study on free radical scavenging activity of three kinds of flavonoids*

ZOU Shu-jun，XU Shu-jun，FU Qi-feng，XU Yang*
（a.Medicine School;b.Expenimental Center,Heilongjiang Univenity of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

In order to compare the free radical scavenging ability of hesperidin，diosmetin and luteolin,the scavenging reaction to 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical（DPPH·）and superoxide free radical（·）of hesperidin，diosmetin and luteolin were tested by UV-Vis spectrophotometry.The result show that three kinds of flavonoids are able to scavenge the two kinds of free radicals,and the scavenying capacity show a concentrationdependent manner.The scavenying activity of DPPH·and·of luteolin is significantly stronger than that of hesperidin and diosmetin．And the scavenying activity difference between hesperidin and diosmetin is not obvious．In flavonoids，B ring 3、4-two hydroxy is an important structural characteristic of free radical scavenging.Single or double bond between C2-C3 didn't has significant effect on free radical scavenging capacity.

flavonoids；diosmetin；luteolin；hesperetin；free radical；scavenging

TS201

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20150504

2015-03-12

黑龙江省教育厅资助项目（No.12531648）；黑龙江中医药大学校基金科研课题（201103）

邹淑君（1974-），女,副教授，黑龙江中医药大学在站博士后工作人员，研究方向:药物分析。

徐暘：女,副教授，研究方向:药物分析。