血小板计数法在绒山羊超早期妊娠诊断上的应用

张兴会，郭祉岐，郭　丹，王家明，赵艳娇，邹丽娜

（1．辽宁省畜牧科学研究院，辽阳 111000；2.辽宁省辽阳市白塔区动物卫生监督管理中心）

血小板计数法在绒山羊超早期妊娠诊断上的应用

张兴会1，郭祉岐2，郭丹1，王家明1，赵艳娇1，邹丽娜1

（1．辽宁省畜牧科学研究院，辽阳 111000；2.辽宁省辽阳市白塔区动物卫生监督管理中心）

选择67只同期发情的绒山羊母羊，人工授精输配28只（试验Ⅰ组），胚胎移植31只（试验Ⅱ组），未受配母羊8只（对照组）。采用血小板计数法对59只受配和移植后母羊进行早期妊娠诊断。结果显示，在发情后第7天，怀孕母羊血小板数值分别降低（63±51.71）×109个/L和（55±32.90）×109个/L，与未配种对照母羊血小板值相比，差异极显著（P＜0.01）；胚胎移植后未孕羊的血小板记数值在发情当天和第7天相差（29±22.56）×109个/L，与对照组差异显著（P＜0.05），与胚胎移植妊娠羊之间比较差异不显著（P＞0.05）。经与临床妊娠检查及产羔结果比较：配种羊妊娠符合率91.30%，未孕羊符合率80.00%，总符合率89.29%；胚移植妊娠羊符合率38.46%，未孕羊符合率77.78%，总符合率61.29%。

血小板计数；绒山羊；超早期妊娠诊断；胚胎移植

早期妊娠诊断技术是绒山羊新品系快繁生产管理上的一项重要内容，通过该项技术可以在母羊怀孕早期，快速准确检测母羊是否怀孕，这对于保胎、缩短胎次间隔、提高繁殖力和经济效益具有重要意义。辽宁省畜牧科学研究院与辽宁省辽宁绒山羊原种场有限公司正在探索和应用小母羊早期利用的快繁技术，即研究应用幼羔早期超排、体外培养、体外受精、胚胎移植等技术，而胚胎移植后的早期胚胎丢失，一直是制约该技术应用的瓶颈问题。运用血小板计数法对绵羊进行超早期妊娠诊断在国内已有报道［1］，且尚未见该方法应用于绒山羊方面的报道。本研究以辽宁绒山羊为研究对象，旨在找出一种绒山羊超早期妊娠诊断方法，同时对分析胚胎移植后母体与孕体间发生排斥的关键期，为提高胚胎移植产羔率，提供生殖基础支持。

1　材料和方法

1.1试验动物

1.1.1试验羊选择 选取辽宁绒山羊科技示范场的3～8岁经产、空怀母羊74只，供试羊采取舍饲方式，营养状态良好，发育及繁殖史正常，无临床可见疾病。

1.1.2试验羊处理采取孕酮栓（CIDR）+孕马血清（PMSG）同期发情方案处理试验羊，其中67只发情，分3组：28只发情羊鲜精人工授精（试验Ⅰ组）、31只在发情后54～64 h进行体外胚的移植手术（试验Ⅱ组）、8只发情羊不做处理（对照组）。

1.2仪器与试剂

生物显微镜，针头，血球记数板，沙利氏吸管，小试管，血小板稀释液，枸橼酸钠，尿素，福尔马林。

1.3方法

制取血小板稀释液，过滤后置于冰箱内。对8只发情后未配种的试验羊在发情后的第0天和第7天分别用10号针头颈静脉采血2～3 mL，放入预先加有抗凝剂的青霉素瓶内，摇匀。然后用沙利氏吸管从中吸取20 μL血液，加入盛有0.4 mL血小板稀释液的小试管内，轻轻摇匀。静置10 min后，吸取一滴充入血小板记数室内，静置10 min，在高倍镜下进行血小板记数；对28只受配母羊和31只移植羊采用同种方法，进行2次血小板计数，第1次在发情当天，第2次在配种或移植后7 d。以配种后7 d检测血小板值，分别降低63×109个/L和55×109个/L以上的母羊为妊娠羊，否则判定为未孕。判定实际妊娠与血小板计数法诊断的符合率。将该方法测定的结果与试验母羊发情后45 d左右的临床妊娠诊断及之后的产羔结果进行比较后，统计羊妊娠符合率、未孕符合率和总符合率，作为下一步试验判定母羊妊娠与否的标准［2］。

1.4数据统计

运用SPSS13.0统计软件对检测数据进行处理分析，结果以平均值±标准差表示，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2　结果与分析

由表1可知，试验中23只人工授精后的妊娠羊，发情时血小板的记数（379±50.03）×109个/L，第7天下降到（316±61.81）×109个/L，差值（63±51.71）×109个/L，与对照组比较，差异极显著（P＜0.01）；13只胚胎移植的妊娠羊，在发情当日血小板数（404±35.14）×109个/L，第7天血小板数下降到（349±48.06）×109个/L，差值（55±32.90）×109个/L，与对照组比较，差异也极显著（P＜0.01）；人工授精后未孕羊的血小板差值与对照比较差异不显著（P＞0.05）。根据配种前后血小板数的变化规律，以配种后第7天血小板值与发情时血小板值之差大于55×109个/L为诊断妊娠的标准。胚胎移植后未孕羊血小板差值与对照组（空怀羊）差异显著（P＜0.05）、与胚胎移植后妊娠羊血小板差值比较差异不显著（P＞0.05）。表明用血小板记数法不能区分胚胎移植羊是否妊娠。

表1　试验母羊的血小板计数值　×109个/L

由表2可知，利用血小板计数法，测得配种羊妊娠符合率91.30%，未孕羊符合率80.00%；胚胎移植后妊娠羊的符合率38.46%，未孕羊的符合率77.78%。应用血小板计数的差额值，推测胚胎移植后妊娠羊为13只，而2个月妊娠诊断实际受孕为5只，这说明有近40%（13/31）移植的受体羊，体外胚在体内可以发育到桑囊胚阶段。

表2　血小板计数法与实际妊娠情况的结果比较

3　讨论与结论

1）采用血小板计数法进行早孕诊断，其技术原理是血小板数量受着床前胚胎释放的一种中性类脂影响［3］，血小板活化因子（PAF）能引起血小板凝集，降低外周血小板数量。利用这一原理，设计出本次试验的检测方法，用于超早孕临床的诊断。从结果可知，受孕羊第7天采血检测的血小板数显著减少，这可能是PAF所致。据报道，PAF能介导妊娠小鼠对胚胎的识别，继而引发血小板数减少，表现出妊娠的生理指标，桑椹胚期间分泌的PAF的含量较大，未受孕鼠则无该现象。绵羊的桑葚胚的形成大约在受精后的第7天。据报道多浪羊在配后第7天所测血小板值较配种时的差值大于70×109个/L，可确定为妊娠［4］。该次试验中检测结果与上述报道相吻合，血小板下降值为60×109个/L，绒山羊和绵羊生理基数不同，可能导致两者差值间有一定间距。由此可见，在配种后第7天采血检测血小板数的变化，也适用于绒山羊的超早期妊娠诊断。

2）采用血小板计数法进行早孕诊断的技术优势与早孕相关的血小板数减少，是母体对妊娠做出的最初的全身性反应，而且是各种动物仅有的早孕性生理变化。采用该方法对绒山羊进行超早孕诊断，不仅测定容易，且准确性也很高。试验中28只配种母羊血液检测，妊娠符合率和未孕的符合率分别达90.48%和80.00%，总符合率为82.41%。因此，采用该方法进行母羊的早期妊娠诊断具有诊断时间超早、诊断相对准确率高、简单易行等优势。

3）由于存在一定比例的胚胎早期死亡现象，因此在进行超早孕诊断为妊娠后，不排除之后又发生隐性流产的可能性，从胚胎移植羊血小板计数的结果判断受胎率为38.46%，而实际受胎率为16.13%（5/31），就表明胚胎存在早期死亡或着床阶段出现问题。这在血小板计数法诊断结果的后期统计和分析中，应作为需要预计到的因素。试验中人工授精羊出现2只、胚胎移植羊出现6只母羊发情期过后又出现发情现象，血小板值第7天检测也有明显降低现象，这可能是隐性流产影响所致［5］。此外，绒山羊血小板数减少也可能是一些疾病所导致的，如贫血、白血病、肝硬化等，因此在早期妊娠诊断时也应考虑和排除这些因素的干扰。

总之，本试验研究表明，血小板记数法对绒山羊进行超早期妊娠诊断具有时间早，方法简单、准确等优点。因未对发情7 d至45 d的母羊做相应的妊娠诊断，胚胎移植中未孕羊胚胎丢失所发生的阶段尚不能作定论。由于本试验样本数较少，可能造成误差，因此此诊断方法的可行性还有待进一步探讨。

［1］ 王念功，马群山，王忠志，等.应用早孕相关性血小板减少对母羊进行超早期妊娠诊断的研究［J］.内蒙古畜牧科学，1993，14（2）：23-25.

［2］ 李玉飞，陈继先，杨世军，等.根据血小板数的变化对猪进行超早期妊娠诊断的研究［J］.黑龙江畜牧兽医，1996（2）：11-15.

［3］ 胡承阅，汪竟成，马丽如，等.胚源性血小板活化因子（EDPAF）及其生理和临床意义［J］.国外医学：计划生育分册，1989（2）：83-85.

［4］ 夏爽，李勤凡，热孜宛古丽·买买提，等.采用血小板计数法对绵羊进行超早期妊娠诊断研究［J］.畜牧与饲料科学，2012，33（4）：19-20.

［5］ 张家骅.反刍动物妊娠识别及早期胚胎死亡［J］.中国兽医杂志，1994（2）：47-48.

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张兴会（1972-），男，高级畜牧师，硕士。