西藏绒山羊GH基因的PCR-RFLP检测及其与生产性状的相关性

吴玉江，益西多吉，富国文，王绍卿，滕晓红，杨凤婷，樊月圆

（1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，拉萨 850009；2.云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201）

西藏绒山羊GH基因的PCR-RFLP检测及其与生产性状的相关性

吴玉江1，益西多吉1，富国文2，王绍卿2，滕晓红2，杨凤婷2，樊月圆2

（1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，拉萨 850009；2.云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201）

利用PCR-RFLP标记技术及序列分析，对245只西藏绒山羊的GH基因的多态性位点进行检测。结果发现：GH基因在西藏绒山羊群体中存在HaeⅢ内切酶位点多态性，存在AA、AB和BB三种基因型，基因型频率分别为0.012、0.610和0.378，PIC=0.339，属于中度多态，经χ2适应性检验，该位点处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P＜0.05）。AB基因型和BB基因型与生产性状相关性分析结果表明，基因型和性别的互作，对研究群体的十字部高、毛长和产绒量有极显著的影响（P＜0.01）。由此可见，GH基因的HaeⅢ内切酶位点可能是影响西藏绒山羊生产性状的主效QTL或与之紧密连锁，可作为西藏绒山羊生产性状的辅助选择标记。

西藏绒山羊；GH基因；PCR-RFLP；生产性状

西藏绒山羊广泛分布在西藏西北部广袤的羌塘草原。阿里地区日土县、那曲地区尼玛县的白绒山羊是西藏绒山羊的典型代表［1］，其突出特点是产绒性能良好、品质优良，绒纤维细度保持在14 μm左右，是山羊绒中的精品［2］。随着青藏铁路的全线通车和农牧民商品意识的不断增强、国内国际市场对羊绒需求量的不断增加，绒山羊产业越来越成为西藏地区畜牧特色优势产业的一大优势和发展重点。

为了保护西藏绒山羊品种的资源优势，使该品种优良的遗传潜力得到充分发挥，本研究以生长激素（growth hormone，GH）基因为候选基因，利用PCR-RFLP技术研究了西藏绒山羊遗传多态性，通过分析GH基因多态性与生产性状关系，旨在获取相应的分子遗传学信息，为西藏绒山羊的选育提高提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1西藏绒山羊耳样采集采集西藏自治区曲尼帕试验站254只周岁西藏绒山羊耳组织样本，公母各半，放入无水乙醇于－20℃保存备用。

1.1.2体尺及产绒指标 包括产绒前体重、体高、体长、胸围、胸深、十字部高、绒长、毛长以及产绒量，数据由曲尼帕试验站提供。

1.2方法

1.2.1西藏绒山羊耳组织样DNA的提取 取15 mg左右的西藏绒山羊耳组织，让其表面酒精挥发后，用剪刀尽可能地将其剪成碎末，转入1.5 mL离心管中。参照DNA提取试剂盒（TaKaRa）说明书进行提取。提取得到的基因组DNA通过核酸蛋白分析仪测定其浓度。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

1.2.2PCR扩增引物序列：5'-GACCCAGTTCACCAGACGA-3'，5'-GGAGAAGCAGAAGGCAACC-3'。引物由上海生物工程有限公司合成。

PCR反应体系：25 μL，包括Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各为0.5 μL，50 ng/μL基因组DNA为1.0 μL，ddH2O补足至25μL。PCR扩增程序：95℃，5min；30个循环（94℃30s，59.7℃40 s，72℃1 min）；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.3PCR产物酶切消化反应与电泳 PCR产物酶切消化反应体系：限制性内切酶HaeⅢ2 μL，10×M Buffer 4 μL，PCR产物8 μL，消化总体积14 μL。37℃孵育4 h。1%琼脂糖凝胶电泳对酶切效果进行检测。

1.2.4统计分析对不同基因型进行统计，计算基因频率，并进行χ2检验。计算纯合度（Ho）、杂合度（He）、多态信息含量（PIC）、有效等位基因数（Ne）。

对不同基因型频率进行统计。运用SPSS13.0软件对数据进行分析，根据最小二乘线性模型，分析GH基因的年龄因素和基因型因素的交互效应，采用了以下固定模型：Yijl=μ+αi+βj+eijl。式中：Yijl为个体表型记录，μ为试验全部观测值总体平均值，αi为性别效应，βj为基因型效应，eijl为随机误差。

2　结果与分析

2.1GH基因的PCR产物检测结果

随机选取6个管的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳后用凝胶成像系统成像，PCR产物片段大小为768 bp（如图1）。条带清晰，无拖尾，无非特异性扩增。其扩增结果稳定，能够完全重复。

图1　西藏绒山羊GH基因的PCR产物检测注：M.DL1000。

2.2酶切结果

PCR产物经HaeⅢ酶切后存在3个酶切位点。在西藏绒山羊群体中存在3种基因型：AA（477/195/93 bp）、AB（477/366/195/93 bp）、BB（366/195/93 bp），如图2所示。

图2　西藏绒山羊GH基因PCR产物的HaeⅢ酶切电泳图谱注：M.DL1000。

2.3GH基因的多态性指标分析

根据电泳结果统计计算了GH基因座的基因频率和基因型频率以及多态信息含量等。统计结果显示，AB（n=155）基因型为优势基因型，频率为0.610；BB（n=96）基因型次之；AA（n=3）所占比例最小，频率仅0.012。等位基因B为优势等位基因，其值为0.683。PIC=0.339，属于中度多态，χ2检验显示，该位点不符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.4西藏绒山羊GH基因多态性与生产性状的相关性分析

考虑到基因型AA在群体中所占比例仅1.2%，无统计价值，本研究只将基因型AB和基因型BB与生产性状作了相关性分析。结果表明：同一性别的不同基因型对生产性状没有产生显著影响（P＞0.05）。而基因型和性别的互作，表现为：体重、体高、体长、胸围、胸深等生长性状指标对研究群体无显著影响（P＞0.05），而十字部高、毛长和产绒量3项指标对研究群体有极显著的影响（P＜0.01）（表1）。由此可见，GH基因不仅对动物的生长有显著影响，而且该基因的变异也对绒山羊的部分产绒指标产生显著影响，其影响机制有待于进一步深入研究。

表1　西藏绒山羊GH基因多态性与生产性状的关联性分析

4　讨论

GH是由动物脑垂体前叶分泌的一种蛋白类激素，它通过调节蛋白质合成、脂肪和糖的代谢，在机体的生长发育、繁殖等方面发挥重要作用［3-4］。山羊的GH基因长为2 544 bp，由5个外显子和4个内含子构成，定位于19q22［5］。Malveiro等［6］对GH基因各外显子的基因型与产奶量、脂肪和蛋白质含量间的关系进行了分析，结果表明GH基因外显子4的基因型F/F个体、外显子5的基因型A/A个体对奶山羊的产奶量有显著影响；纪英卓［7］在对GH基因的多态性与经济性能的相关性进行分析中，发现GH基因的HaeⅢ内切酶位点存在2种基因型AA和AB，各基因型与产羔性状无相关性，而与产绒量、绒长及体重间存在一定的相关性，在产绒量和绒长指标上，AB基因型个体均高于AA基因型个体；在体重指标上，AA基因型个体显著高于AB基因型个体。李美玉等［8］以鲁北白山羊、引进波尔山羊、纯繁波尔山羊、鲁北白山羊×波尔山羊的杂交一代、回交一代5个不同山羊为研究材料，对山羊生长激素基因的第1内含子到第2内含子进行PCR-RFLP分析，扩增产物经限制性内切酶HaeⅢ、HhaI、TaqI等10种内切酶酶切只有HaeⅢ在5个种群中均具有多态性，并表现为两种基因型（AA和AB），而其它的内切酶均未发现多态性位点；谷朝勇［9］对济宁青山羊GH基因HaeⅢ酶切位点与生产性能的关联分析研究显示，AA基因型对3、12月龄体高及出生重、断奶重、胴体重、后躯肉重均有显著影响。哈志俊等［10］对GH基因进行检测，仅在第4外显子检测到多态性。

本试验采用PCR-RFLP技术，对西藏绒山羊GH基因HaeⅢ内切酶进行酶切，酶切片段包括GH基因的第1内含子到第2内含子，酶切结果表现为3种基因型（AA、AB和BB），遗传学指标显示，AB基因型为优势基因型，B等位基因为优势等位基因，该研究结果与纪英卓［7］及李美玉等［8］的研究结果不同，在西藏绒山羊群体中首次发现了BB基因型，同时AA基因型在西藏绒山羊群体中的变异频率很低（=1.2%），由于AA基因型所占比例较小，本研究只进行了AB基因型和BB基因型与西藏绒山羊生产性状的相关性分析，研究结果显示，年龄和性别的互作，导致该位点对西藏绒山羊的十字部高、毛长和产绒量指标有极显著的影响（P＜0.01）。究其原因可能与西藏绒山羊品种本身有关，同时西藏的高原气候以及人工选育的强度可能也是造成这个差异的原因之一。

［1］ 高雪峰，邢玉梅.我国绒山羊品种资源现状及发展对策［J］.中国草食动物，2011，31（6）：50-53.

［2］ Gillespie J M，Frenkel MJ.The tyrosine-rich proteins ofkeratins，Occurrence，properties and regulation of biosynthesis［J］.Proceedings of the 5th International Wool Textile Research Conference 1975 Aachen，1976，II：265-276．

［3］ Miller W L，Eberhartt N L.Structure and evolution of the growth hormone gene family［J］.Endocrine Review，1983，4：97.

［4］ 孙逊，朱尚权.生长激素的结构与功能［J］.国外医学-生理，病理科学与临床分册，1999，19（4）：6-9.

［5］ Gupta N，Ahlawat S P S，Kumar D，et al.Single nucleotide polymorphism in growth hormone gene exon-4 and exon-5 using PCR-SSCP in Black Bengal goat s-Prolific meat breed of India［J］.Meat Science，2007，76（4）：658-665.

［6］ Malveriro E，Pereira M，Marques P X，et al.Polymorphisms at the five exons ofthe growth hormone gene in the aslgarvia goat;possible association with milk traits［J］.SmallRuminantResearch，2001（41）：163-170.

［7］ 纪英卓.辽宁绒山羊4个功能基因的遗传多态性及其与部分经济性状的相关性研究［D］.沈阳：沈阳农业大学，2007.

［8］ 李美玉，潘庆杰，潘玉春，等.山羊生长激素基因的PCR-RFLP多态性研究［J］.莱阳农学院学报，2004，21（1）：6-9.

［9］ 谷朝勇.济宁青山羊GH基因多态性及其与生产性能的关联分析［J］.中国畜牧兽医，2010,37（8）：138-141.

［10］哈志俊，张利平，杨联，等.欧拉型藏羊GH基因部分序列PCR-SSCP分析［J］.中国草食动物，2010（专辑）：206-209.

Analysis on the Polymorphism of GH Gene and Its Association with Production Traits in Tibetan Cashmere Goats

Wu Yujiang1，Yixi Duoji1，Fan Yueyuan2，et al
（1.Institute ofAnimal Sciences，Tibet AcademyofAgricultural Sciences，Lhasa 850009，China；2.College ofAnimal Science&Technology，Yunnan Agriculture University，Kunming 650201，China）

PCR-RFLP and sequence analysis technology were applied to analyze the polymorphic loci of GH gene in 245 Tibetan Cashmere Goats.The results showed that the restriction endonuclease HaeIII polymorphism was found in GH gene in Tibet Cashmere Goat populations with three genotypes of AA，AB and BB，the genotype frequencies were 0.012，0.610 and 0.378 respectively，the PIC=0.339，which was in a moderate polymorphism.Chi-square test showed that the locus was not in Hardy-Weinberg equilibrium（P＜0.05）.Correlation analysis between AB，BB genotypes and the production traits showed that there were some interactions between genotype and sex，the interaction had significant effects on height at hip cross，wool length and cashmere yield（P＜0.01）.These findings demonstrated that Hae III restriction endonuclease sites of GH gene might be the main effect QTLofproduction traits，and could be a candidate as a marker for the production ofTibet Cashmere Goat.

Tibetan Cashmere Goat；GH gene；PCR-RFLP；production traits

S827.2

A

2095-3887（2015）01-0015-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.01.005

2014-12-23

现代农业产业技术体系建设专项资金资助（CARS-40-31）；西藏科技厅畜禽育种项目资助；家养动物种质资源平台资助

吴玉江（1979-），男，硕士。

樊月圆（1979-），女，博士，主要从事动物遗传育种与繁殖研究。