甘南欧拉羊GHR基因第10外显子SSCP多态性与生长性状关联研究

2015-11-24 13:03杨树猛卡召加王兰英穆峰海牟永娟普华才让
中国草食动物科学 2015年1期
关键词:甘南州多态欧拉

杨树猛,卡召加,王兰英,穆峰海,牟永娟,普华才让

(1.甘南州畜牧科学研究所,甘肃合作747000;2.甘南州河曲马场;3.甘南州草原工作站;4.甘南州畜牧学校)

甘南欧拉羊GHR基因第10外显子SSCP多态性与生长性状关联研究

杨树猛1,卡召加2,王兰英3,穆峰海4,牟永娟1,普华才让1

(1.甘南州畜牧科学研究所,甘肃合作747000;2.甘南州河曲马场;3.甘南州草原工作站;4.甘南州畜牧学校)

采用PCR-SSCP技术对120只甘南欧拉羊GHR基因的部分序列进行了多态性研究,分析了该基因与藏羊生长性状的关联性。结果表明:欧拉羊GHR基因外显子10存在2个等位基因和3种基因型。在该基因座上,欧拉羊呈Hardy-Weinberg平衡状态。3种基因型与甘南欧拉羊部分生长性状的最小二乘法分析表明,GHR基因外显子10不同基因型个体间3月龄体高差异显著(P<0.05或P<0.01),6月龄AA型个体体重显著高于AB型和BB型(P<0.05),12月龄AA型个体体高和体重均显著或极显著高于AB型和BB型(P<0.05或P<0.01)。初步推断藏羊GHR基因第10外显子基因座的A为优势等位基因,提示该位点可作为欧拉羊标记辅助选择的遗传标记之一。

欧拉羊;GHR基因;多态性;性状标记;PCR-SSCP

生长激素受体(GHR)是生长激素受体蛋白,是细胞因子/造血因子受体超家族成员之一。生长激素必须与其受体蛋白结合激活一系列的生化反应,最终才能产生生物学效应。研究表明,生长激素受体基因的突变会影响生物个体的生长发育,如人的LTD矮小症、性连锁矮小鸡等均是GHR基因突变所致[1-2]。Feng等[3]研究表明,母鸡GHR的2个等位基因与幼龄期体重和产蛋量相关,随后研究又发现HindIII-RFLP多态与肉用仔鸡的体重相关,含有HindIII+等位基因的肉鸡130日龄体重大。Hale等[4]研究发现,在牛GHR基因启动区(TG)n存在微卫星多态,(TG)16-20纯合基因型的个体断奶重和胴体重都高。Adams等最早对绵羊GHR基因进行了cDNA克隆研究,表明绵羊GHR是由634个氨基酸组成的多肽,成熟的GHR由242个氨基酸组成的胞外区、24个氨基酸组成的跨膜区和350个氨基酸组成的胞内区组成;在GHR基因核苷酸及其相应的氨基酸序列比较分析中,绵羊与人、兔子、牛等哺乳动物间具有较高的保守性[5]。

欧拉羊是藏羊的一个类型,主要分布在甘肃省甘南州玛曲县欧拉地区,以境内的欧拉山而得名。欧拉羊产肉性能优良,对高海拔、低气压、少氧量有高度的适应能力,现存栏约18万只。但是,近年来由于缺乏科学的选配、选留,近亲繁殖严重,饲养管理粗放,交配年龄难以控制等因素影响,欧拉羊生产性能明显下降,品种退化严重,品种质量下降[6]。因此,利用传统的育种技术结合现代分子标记技术开展欧拉羊选育,是遏制欧拉羊退化的有效手段。但有关欧拉羊GHR的多态性研究较少,本研究将以GHR基因为候选基因,对第10外显子多态性进行检测,并分析基因型与生长性状的关系,以期发现与生产性状相关的分子标记,为欧拉羊GHR基因的分子生物学研究及分子育种奠定理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

在甘肃省甘南州玛曲县随机采集成年欧拉羊血样120头份,每只羊颈静脉采血5 mL,用ACD抗凝后带回实验室,置于-70℃低温保存待测。同时,对采血欧拉羊只收集3月龄、6月龄、12月龄的体尺指标(体长、体高、胸围)和体重指标。

1.2试验方法

1.2.1基因组DNA的提取 采用常规的酚-氯仿抽提法从全血中提取欧拉羊基因组DNA[7]。每100 μL全血中提取的DNA用50 μL的TE缓冲液溶解,4℃保存。

1.2.2引物设计与合成参照牛GHR基因序列(Gen-Bank,AY292283),用Primer 5.0软件设计一对引物,预期扩增长度为218 bp。上游引物:5'-GCCAAAACAATAAGACTGGGAACC-3',下游引物:5'-GGCTGTAGTGGTAAGGCTTTCTGTG-3',由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3PCR-SSCP反应条件 PCR反应体系为20 μL。其中10×buffer 2.0 μL,dNTPs 1.6 μL(2.5 mmoL/L),上、下游引物各0.4 μL(10 mmoL/L),Taq酶0.5 μL(5 U/μL),模板1.0 μL,ddH2O13.1 μL。反应程序:95℃预变性4 min,95℃45 s,60℃30 s,72℃30 s,34个循环;72℃再延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶检测后置于4℃冷藏保存供SSCP分析。

扩增产物的SSCP分析,3 μLPCR产物和7 μL变性剂混匀,98℃变性10 min,冰浴10 min。变性后PCR产物以10%聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺= 29:1)常温电泳过夜,银染显带。

1.2.4PCR产物回收、测序将不同基因型的纯合子个体的PCR产物回收纯化(天为时代回收试剂盒),纯化的DNA片段与pGEM-Teasy载体(Promega公司)在T4DNA连接酶(Promega公司)的作用下4℃冰箱中连接12 h,取2.5 μL连接液进行转化,培养12~16 h,挑取白斑,摇菌4 h,取菌液做PCR,检测克隆效果后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.3统计方法

1.3.1计算基因型频率和基因频率,进行群体平衡性检验 某基因位点的Hardy-Weinberg平衡性检测采用皮尔逊χ2统计量,其公式为:

其中,m为某一遗传位点基因型应有个数;i为基因型序号;fi代表第i个基因型的实际个体数量;n为样本数量;pi代表第i个基因型的理论频率。

1.3.2基因多态性与甘南欧拉羊生长发育性状的关联分析 在数据处理中,根据影响生长发育性状的因素不同,考虑到年龄和性别效应以及遗传效应,分析时采用了以下固定模型:

其中:yijm为个体表型记录;Ai为年龄效应;Sj为性别效应;Mm为标记基因型效应;eijm为随机误差。采用SPSS 18.0对数据进行分析,并用最小二乘法拟合线性模型,对各标记基因型间生长发育指标进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1PCR-SSCP检测

GHR基因外显子10的PCR-SSCP分析表明,该位点存在3种基因型,即AA,AB,BB,由一对等位基因A和B控制。将两个纯合基因型个体的PCR产物进行纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,结果发现AA型与BB型相比,在扩增片段发现一个A转换G的单碱基突变。其电泳结果见图1。

图1 甘南欧拉羊GHR基因外显子10的PCR-SSCP图谱

2.2基因座的遗传结构分析

由表1可知,在所检测的欧拉羊群体中发现AA、AB和BB3种基因型,其中以AB为优势基因型,A为优势基因。χ2检验结果显示,在该基因座上,甘南欧拉羊群体点上处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。基因杂合度表示群体在某座位杂合子的比例。位点平均杂合度近似反映遗传结构变异程度高低,杂合度越大变异越大,对环境适应能力越强。甘南欧拉羊GHR基因的杂合度达0.474 7(见表1),所以甘南欧拉羊群体的遗传多样性较高。平均多态信息含量(PIC)是衡量基因片段多态性的理想指标,当PIC>0.5时,该座位为高度多态性座位;当0.25<PIC<0.5时,该座位为中度多态性座位;当PIC<0.25时,该座位为低度多态性座位。甘南欧拉羊群体的GHR基因的PIC=0.362 0,呈现中度多态性。

表1 甘南欧拉羊群体GHR基因第10外显子基因座的遗传多样性

2.3欧拉羊GHR基因外显子10多态性与生长发育性状关联

由表2可知,对GHR基因研究发现,3月龄甘南欧拉羊AB基因型的体高显著高于AA型(P<0.05),极显著高于BB型(P<0.01);AA基因型的胸围显著高于AB型和BB型(P<0.05)。6月龄甘南欧拉羊AA基因型的体重显著高于AB型和BB型(P<0.05)。12月龄甘南欧拉羊AA基因型的体高显著高于BB型(P<0.05)和AB型(P<0.05),体重极显著高于AB型(P<0.01)和BB型(P<0.01)。其他指标在不同基因型间均没有显著性差异(P>0.05)。

表2 不同基因型对欧拉羊生长发育性状的影响(Mean±SE)

3 讨论

研究影响生长性状的基因对我国地方绵羊品种向肉用方向培育具有重要意义。欧拉羊是甘南藏羊品种中的一个优良地方类群,有较好的肉用性能,深受农户的欢迎。生长激素受体由Leung(1987)首次从兔肝脏组织中提取纯化获得,后又根据其氨基酸序列从兔肝脏cDNA文库中克隆出GHR基因的cDNA序列,此后人们相继克隆出人、小鼠、大鼠、绵羊、牛、鸡等20多种动物的cDNA序列[8]。

许多研究表明,GHR基因可以作为影响绵羊生长性状的候选基因。目前已有很多关于GHR基因多态性与生产及产奶性状的相关研究,并发现了一些对生产及产奶性状有影响的多态位点。Ge等[9]在牛第10外显子内发现了4个SNPs,分别位于76 bp(T/C)、200 bp(G/A)、229 bp(T/C)和257 bp(A/G)处,其中200 bp和257 bp处的SNPS引起了氨基酸的替代,另外两个发生无义突变。Curi等[10]发现S等位基因与L等位基因的杂合型具有较高的日增重和体重(P<0.05)。Hale等[11]研究了6个家系安格斯牛GHR基因启动区(TG)n微卫星多态与生产性能的关系,发现纯合基因型对安格斯牛的断奶重和屠体重有明显影响。秦巧梅等[12]利用PCR-SSCP技术对南阳牛、利木赞牛、盖洛威牛的生长激素受体基因的外显子10部分序列研究发现,3个品种中共存在6种基因型,其中利木赞牛和盖洛威牛表现为中度多态,而南阳牛表现高度多态,发现的5处多态位点分别与不同年龄牛的生长性状有一定的相关性。赵高锋等[13]研究了秦川牛GHR基因第10外显子多态性,发现了A、B、C 3个等位基因,测序发现在该位点存在2个突变位点,各基因型与生长性状的关系分析表明,AB基因型效应在生长性状上高于其他基因型,并认为该位点可能成为秦川牛生长性状的候选位点。张春香等[14]研究南江黄羊和波尔山羊群体,发现GHR基因5′调控区存在多态,多态位点在南江黄羊和波尔山羊群体中对初生重影响不显著(P>0.05),对周岁体重有显著影响,说明该多态性与山羊的生长速度有关。本研究发现,AA型个体在各项指标群体均值上均高于AB型个体和BB型个体,提示A等位基因有利于生长发育,而B基因则有可能是不利于生长发育的基因。A、B基因频率较高(0.612 5、0.318 5)可能正是长期进化的结果。

生长性状是一个数量性状,受多个基因控制,单个基因作用较小。从本试验结果看,具有显著性差异的生长指标间AA型个体虽然在各项指标的群体均值上都高于其他型个体,但是差异达显著水平指标的基因型群体较少,说明GHR基因的作用比较轻微。提示人们在进行育种工作时,应结合多个基因位点,才能达到有效选育的目的。

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[13]赵高锋,陈宏,雷初朝,等.秦川牛GHR基因SNPs及其与生长性状关系的研究[J].遗传,2007,29(3):319-332.

[14]张春香,罗海玲,陈喻,等.南江黄羊GHR基因5-调控区多态与体重性状相关性研究[J].遗传育种,2007,43(15):4-7.

过刊征订

1.《中国草食动物》杂志1999年(1~6期)21元,2000~2002年(1~6期)27元,2003年(2~6期)33元,2004~2008年(1~6期)39元,2009、2010、2011、2012、2013年(1~6期)48元(均含挂号邮资);

2.有2002、2003、2004、2005、2006和2007年养羊专辑(包括品种、遗传、繁育、营养、市场等内容),价格分别为31、34、26、58、38、28元,含挂号邮资,数量有限,欲购从速;

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《中国草食动物科学》杂志社

Study on the Association of Single Nucleotide Polymorphism at Exon10 of GHR Gene with Growth Traits in Oula Sheep

YangShumeng1,Ka Zhaojia2,Mu Yunjuan1,et al
(1.Institute ofAnimal Science ofGannan Tibetan Autonomous State,Hezuo747000,Gansu,China;2.Hequ Horse Pasture ofGannan Tibetan Autonomous State)

The polymorphism of growth hormone receptor(GHR)gene sequence of exon 10 and its correlation with growth traits were investigated in 120 individuals from Gannan Oula sheep with PCR-SSCP.The results showed that there were twoalleles and three genotypes in the locus of GHR gene exon 10.They were at Hardy-Weinberg equilibrium state in this locus.The least square analysis showed that the different genotype ofGHR exon 10 had a significant effect on partial traits ofgrowth includingheart girth,bodyweight(P<0.05),and the genotype did not affected the bodylength(P>0.05).Therefore,the allele Amaybe a dominant allele at the exon 10 ofOula sheep GHR gene.These results implythat the mutation could be used as the molecular genetic marker for Oula sheep breeding.

Oula sheep;GHR gene;PCR-SSCP;polymorphism;genetic marker

S826.2

A

2095-3887(2015)01-0001-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.01.001

2014-10-16

甘肃省科技支撑计划项目“欧拉羊优质种羊选育集成技术研究与制种供种示范”

杨树猛(1976-),男,高级畜牧师。

牟永娟(1980-),女,高级兽医师。

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